高效液相色谱仪用于肉制品氯霉素残留检测的探讨

2018-05-14李梦琪卢伟峰褚应君马淑丽于雪双李阳马悦孙威葛杰

中国卫生产业 2018年12期

李梦琪卢伟峰褚应君马淑丽于雪双李阳马悦孙威葛杰

[摘要] 该文通过对氯霉素药物残留检测方法的建立及探讨以期对我国食品（尤其是动物性食品）中氯霉素类药物的残留检测方法提供一定的技术支持。该实验通过建立高效液相色谱法（HPLC）市售禽畜肉氯霉素含量，以便了解市售禽畜肉氯霉素的残留现状并对检测方法进行探讨，为食品安全监管部门提供检测方法和信息。通过建立高效液相色谱法对禽畜肉食品中氯霉素残留检测，该方法可靠、准确、灵敏度高；线性范围、回收率、精密度较好，同时参考其部分缺点应适当考虑联合其他方法改进完善，建立更为高效、更为适合的禽畜肉食品中氯霉素残留检测方法。

[关键词] 禽畜肉食品；抗生素；氯霉素；高效液相色谱

[中图分类号] R1 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2018）04（c）-0173-04

Study on High Performance Liquid Chromatography in the Test of Chloramphenicol Residue of Meat Products

LI Meng-qi， LU Wei-feng， CHU Ying-jun， MA Shu-li， YU Xue-shuang， LI Yang， MA Yue， SUN Wei， GE Jie

Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161006 China

[Abstract] The paper provides a certain technological support by establishment of chloramphenicol residue test method. The paper establishes the chloramphenicol content of poultry and livestock meat for sales by HPLC in order to know the chloramphenicol residue status and study the test method thus providing test method and information for the food security supervision departments， and the method is reliable and accurate with high sensitivity， and better liner range， cycle rate and precision， at the same time， we should properly consider the improvement combined with the other methods according to some disadvantages， to establish the more effective and proper chloramphenicol residue of meat products.

[Key words] Poultry and livestock meat； Antibiotic； Chloramphenicol； HPLC

近年来，禽畜肉食品的安全问题已为社会所共同关注，而其中最常见和最重要的污染源为氯霉素。氯霉素的不规范使用极易导致动物体内药物的滞留、蓄积，并以残留的方式通过食物链进入人体和生态系统。人们长期摄入含氯霉素的食品后，抗生素在人体内不断蓄积，当积累到一定程度后，就会对人体产生毒性作用，导致人的过敏反应、致畸、致突变和激素样作用等方面的不利影响。

氯霉素检测方法比较多，主要有微生物检测技术、免疫检测技术、理化检测技术等，如高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法、TLC法联用技术（常见的联用技术有TLC-MS、GC-MS、LC-MS、CZE-MS、LC-NMR、SFC-MC）等等。该文采用高效液相色谱法测定市售禽畜肉氯霉素含量，参考《畜禽肉中氯霉素的测定（SB/T 10386—2004）》，并在此基础上进行调整。

1 实验材料

1.1 仪器

液相色谱系统[1]：LC-5510型高效液相色谱仪、紫外-可见光检测器、P-101A高压恒流泵、DW-101在线脱洗器、LC-5510色谱工作站；LDZ5-2低速自动平衡离心机；RE-5299旋转蒸发器；SHZ-D（III）循环水式真空泵；QL-861涡流振荡器；KQ-500型超声波清洗器；DS-1高速组织捣碎机；AL204电子天平；0.22 μm有机微孔滤膜；0.45 μm水相膜；5 mL注射器；10 μL微量进样针；冰箱；各种玻璃仪器。

1.2 试剂

氯霉素标准品；乙酸乙酯；甲醇；正己烷。实验用水均为超纯水。甲醇为色谱级，其他试剂为分析纯。

1.3 样品

市售鸡肉、猪肉和牛肉的肌肉组织样品和鸡肝脏、猪肝脏和牛肝脏样品。

2 实验方法

该实验方法参考《畜禽肉中氯霉素的測定（SB/T 10386—2004）》，并在此基础上进行调整。

2.1 标准溶液的配制

①氯霉素标准储备液的配制。准确称取0.010 g氯霉素标准品，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。此溶液浓度为0.10 mg/mL，置于冰箱中保存，有效期3个月。

②氯霉素标准工作液的配制。准确吸取5.0 mL氯霉素标准储备液于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。此溶液浓度10.0 μg/mL，置于冰箱保存。有效期半个月。临用前取此液用甲醇稀释成适当浓度的标准工作液。

③标准工作溶液系列的配制。用精密移液管分别吸取5、10、20、30、40、50 mL工作液于6个50 mL容量瓶中，分别用甲醇定容至刻度，混匀。配制为1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL标准工作溶液。

2.2 流动相的配制

将甲醇（色谱纯）经溶剂过滤器过滤两遍，纯水机取超纯水经溶剂过滤器过滤两遍。准确吸取700 mL甲醇溶液，300 mL超纯水，将甲醇溶液与超纯水以70：30体积比混合。

2.3 样品前处理方法

①提取。取200 g试样绞碎，称取20 g（精确至0.01 g）绞碎后的试样，置于100 mL具塞三角瓶中，加入40 mL乙酸乙酯，振摇，超声提取30 min，过滤，滤液放于另一三角瓶中。再加入20 mL乙酸乙酯于试样中，超声提取15 min，过滤，滤液合并，滤渣再加20 mL乙酸乙酯超声提取15 min，过滤，滤液合并，全部滤液合并转入浓缩瓶中[2]。

②净化。将合并的滤液于52～55℃水浴旋转蒸发仪上浓缩至干。准确加入1.0 mL甲醇溶液洗涤浓缩瓶中残留物，再加入1 mL正己烷，振摇1 min，将全部溶液转移至5.0 mL试管中，静置分层，吸弃正己烷层，再加入2 mL正己烷提取脂肪，再吸弃正已烷层[3]。

③过滤。将样品溶液过0. 45 μm有机微孔滤膜，直至溶液不分层、无浑浊为止，进行HPLC分析。

2.4 色谱条件

色谱柱：Symmetry C18，150 mm×4.6 mm，5 m；甲醇、超纯水以体积比70：30混合；流动相流速为1.0 mL/min；进样量10 μL；检测波长280 nm；柱温：20℃。

2.5 样品测定

分别用进样器吸取10 μL鸡肉、猪肉和牛肉的肌肉组织样品和鸡肝脏、猪肝脏和牛肝脏样品溶液和氯霉素标准系列溶液，进行单点和多点校准。根据溶液所得色谱图，观察每个色谱图出峰的保留时间（结合最大吸收波长、峰纯度、峰的匹配程度）以定性，依据峰面积积分值定量，保证鸡肉、猪肉和牛肉的肌肉组织样品和鸡肝脏、猪肝脏和牛肝脏样品溶液及标准系列溶液中氯霉素含量的响应值在仪器检测的线性范围内。

2.6 计算公式

①样品中氯霉素残留量的计算，将标准曲线各点的浓度与对应的峰面积进行回归分析，然后按照下式分别计算供试样中氯霉素的含量。

式中：X——样品中氯霉素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）

c——被测液中氯霉素的含量，单位为微克每毫升（μg/mL）

V——被测液体积，单位为毫升（mL）

m——样品质量，单位为克（g）

②精密度的计算。相对标准偏差（RSD）的计算公式为：

其中，SD（标准偏差）的计算公式为：

式中：Xi——单次分析数值；X——样品分析结果的平均值； n——测量次数，n=1，2，3，...，n

③回收率的计算

式中测量值、添加量根據计算方法①（氯霉素残留量的计算）、所测的峰面积以及所得的标准曲线获得。

3 结果

3.1 工作曲线的绘制

按实验方法配制1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL氯霉素标准系列工作溶液，进样10 μL进行测定，每个浓度浓度进样3次，3次进样峰面积取平均值，将其所得的峰面积值与对应的标准溶液浓度作散点图，依据散点图确定标准曲线的线性范围，进行定量分析。求得回归方程为，决定系数为0.99 939，线性范围是1～10 μg/mL。氯霉素标准系列溶液工作曲线见图1。

图1 氯霉素标准系列溶液工作曲线

3.2 精密度

取2 μg/mL和4 μg/mL氯霉素标准品溶液，在选定的色谱及质谱条件下，于0、1、2、3、4、5 h分别进样测定，每次进样10 μL，根据峰面积算得RSD分别为0.78%和0.85%（表1）。说明该方法的重现性良好。

表1 2 μg/mL和4 μg/mL氯霉素标准品重复性实验

3.3 回收率

在禽畜肉（鸡肉、牛肉、猪肉各3份，每份20.00 g）样品中，分别加入10 μg /mL氯霉素标准工作溶液，按测定0.5、0.75、1.0 mL 3个水平浓度添加混合标准液进行回收实验。按照上述方法进行样品前处理，HPLC测定，每个浓度样品重复测定3次，分别计算回收率[5]，结果见表6。结果显示：在鸡肉、猪肉和牛肉中氯霉素的回收率分别是91.33%～93.8%，89.62%～90.33%，94.68%～96.24%。

3.4 样品检测

分别取不同样品溶液（鸡肉、猪肉和牛肉的肌肉组织样品和鸡肝脏、猪肝脏和牛肝脏样品溶液）10 μL，注入高效液相色谱仪中，每一样品进样3次，测得的峰面积值带入工作曲线计算出相应的氯霉素浓度。结果显示，鸡肉、猪肉和牛肉的肌肉组织样品溶液均未在保留时间4.5 min左右出峰，而加入标准氯霉素后的样品溶液在4.5 min左右均出峰。由此得知，样品（鸡肉、猪肉和牛肉的肌肉组织样品）溶液中均未检出氯霉素。

4 讨论

4.1 实验方法的优缺点

高效液相色谱法兼分离、定量和定性于一体，特别适用于确证性分析。该法灵敏度高，抗干扰能力强，具有精确可靠、重复性好、灵敏度高、假阳性少等优点[6]，它也是美国 FDA 推荐使用的氯霉素确证方法。

其缺点也同样包括处理过程复杂、耗时长、成本高、分析速度慢、回收率偏低等诸多方面，运行成本高，检测过程复杂，劳动强度大，不适合用于大规模的样品检测[7]。

4.2 实验条件的优化

①流动相的优化。为了使物质分离较好和灵敏度高，需要对流动相条件进行选择。该次实验尝试以甲醇-超纯水（45：55）、甲醇-超纯水（60：40）、甲醇-超纯水（70：30）、甲醇-超纯水（75：25）组成的流动相体系。结果发现，从保留时间与样品杂峰的分离上考虑，以甲醇-超纯水（70：30）作为流动相时，各组分得到较好的分离，减小样品杂峰的干扰。

②检测波长的优化。根据相关等研究得知[6]，在230 nm，270 nm波长处氯霉素都有较好的吸收。在相同的分离条件下，分别用230 nm，270 nm波长对加标样品进行检测，实验发现：在230 nm，270 nm波长处测定都未能有效分离，并共存干扰物的影响。由于该次实验使用LC-5510型高效液相色谱仪，其最优吸收波长为280 nm。尝试将检测波长调整为280 nm时，氯霉素吸收增大，能有效分离，并无共存干扰物的影响。因此，该实验采用280 nm波长进行检测。

③柱温的优化。柱温是影响组分分离度的因素之一，该研究比较了氯霉素在流动相及流速固定条件下，柱温分别为17、18、19、20℃时的保留时间和分离效果，柱温为17℃和20℃时，各物质保留时间变异很小，且分离效果较好，出峰形状良好；当柱温升高到25℃时，其保留时间变短且分离度变差；柱温20℃时，基线较平稳，氯霉素与杂质分离效果较好，出峰形状良好，并且有利于氯霉素信号的辨别，故该实验柱温选20℃。

④色谱柱的优化。目前，是最普遍采用的柱填料是非极性烷基键合相。其中十八烷基硅烷键合相（octadecylsilyl，ODS）在反相液相色谱中起着举足轻重的作用，它可完成高效液相色谱分析任务的70%～80%。反相液相色谱系统操作简便，重复性与稳定性较好，是一种通用型液相色谱分析方法。它可将极性、非极性；离子型、非离子型；水溶性、脂溶性；小分子、大分子等几乎遍及所有类型的有机化合物作为分析对象；同时也能将具有官能团差别或分子量差别的同系物用反相液相色谱技术实现分离。因此氯霉素作为中等极性化合物，反相柱的分离方法可以适用。文献中多用C18柱进行分离，根据现有实验条件，采用Symmetry C18，150 mm×4.6 mm，5 μm液相色谱柱。

⑤提取试剂的优化。该实验方法参考《畜禽肉中氯霉素的测定（SB/T 10386—2004）》，并在此基础上进行调整。进过反复预实验发现加入高氯酸溶液提取样品后，进样测得保留时间提前，高氯酸出现分离峰并遮挡氯霉素标准品出峰，经过反复试验改良，将高氯酸替换为甲醇进行标准系列浓度的配制和样品前处理。结果绘制标准曲线满意，浓度与峰面积线性关系良好，样品出峰良好。

4.3 实验方法优化

①色谱-质谱联用。采用色谱-质谱联用的方法能够同时发挥色谱和质谱的优点。主要有气相色谱-质谱联用（gas chromatograph-mass spectrometer， GC-MS）和液相色谱串联质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS）法。国标方法中氯霉素类药物的检测方法采用GC-MS和LC-MS/MS[8]。其中气相色谱法采用负化学源，具有较高的灵敏度，CAP的检出限为0.1 g/kg、FF以及TAP的检出限为0.5 μg/kg。由此使液相色谱-质谱或质谱法三者的检出限达到0.1 μg/kg。在孙雷等的研究中[9]牛乳、猪肝、猪肉中CAP、TAP、F F和FFa残留检测采用超高液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析方法。与其他方法不同的是，提取药物残留使用碱性的乙酸乙酯，再用正己烷去除基质中的脂肪，这样可以省去固相萃取的步骤。这种方法能够做到在2～500 μg/mL的质量浓度范围内呈良好的线性关系，保证检测物质平均回收率均在70%～120%范围内。在杨成对等（2004）用 HPLC-MS 方法定量检测对虾中微量的氯霉素残留[10]研究中。采用乙酸乙酯超声提取对虾组织中的氯霉素残留，并以甲醇为流动相，氯霉素的检测离子对的选择被设计为m/z321/152，再利用多反应监测（MRM）技术进行测定。做到检测的线性范围是 0.28～28.0 ug/L；相关系数为0.999 91。氯霉素的定量检测下限是 0.07 ug/kg，保证平均回收率在 89% 以上。同单一高效液相色谱法检测氯霉素残留相比可以看出其灵敏度較高、准确性良好、检测范围较广、应用性更强。

虽然采用色谱-质谱联用的分析方法具有准确、灵敏、检测限低等优点，但同时样品的前处理复杂、的大型精密仪器的要求较高、检测费用居高不下，大大增加了检测的复杂程度和推广难度[11]。

②酶联免疫法与液相色谱-质谱法联用。在高效液相色谱法或质谱法测定动物源性食品中氯霉素残留量实际操作过程中发现，在两种方法的比较之下酶联免疫法拥有操作简便、灵敏度高、样品预处理简单的优点，能够进行批量检测，分析成本低。但是酶联免疫法缺点在于影响结果的因素较多，易出现假阳性结果，这种方法在检出低含量样品的时候尤其值得注意。另外，抗体批次不同，测定结果也会出现差异等，但该法作为一种快速筛选手段，使得其在现场监控和大规模筛选检测中有广阔的应用前景[12]。液相色谱 -质谱联用技术兼分离、定量和定性于一体，特别适用于确证性分析。该法灵敏度高，抗干扰能力强，是美国FDA推荐使用的氯霉素确证方法，但是运行成本高，检测过程复杂，劳动强度大。通过以上比较分析，在实际检测工作中可采取先用酶联免疫法作初步筛选，把检出阳性反应的样品进一步使用液质联用法进行定性和定量，这种联用的方法能够大大减少检测费用以及降低劳动强度[13]。

综上所述，在现有的氯霉素残留的检测方法中，色谱法、色/质谱联用法依旧是目前国际上公认的确证方法，但同时其仍需不断地加以完善，以求简化操作过程、改进仪器设备、降低检测成本。作为半确证筛选方法的酶联免疫吸附法，与色/质谱联用技术等确证方法的配合使用，将是今后氯霉素残留检测的具有前景的发展趋势[7]。

[参考文献]

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[3] 杨大进，蒋定国，王竹天，等.畜禽肌肉、内脏及虾中氯霉素残留量的检测技术研究[J].卫生研究，2004，33（2）：198-201.

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[7] 宋巍巍，柴春彦.动物性食品中残留氯霉素检测方法的研究进展[J].畜牧与兽医，2007，39（4）：54-57.

[8] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 22338—2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定[S].北京：中国标准出版社，2008.

[9] 孙雷，张骊，王树槐，等.超高效液相色谱-串联质谱法检测动物源食品中氯霉素类药物及其代谢物残留[J].中国兽药杂志，2009，43（3）：42-45.

[10] 孙亮，陈海东.GC-MS/MS测定虾仁中氯霉素的研究[J].中国卫生检验杂志，2003，13（3）：293-294.