浅谈核酸检测实验室防污染措施

薛秀荣 来祝檩 韩惠云

[摘要] 血站开展核酸检测是保证血液安全的重要举措。气溶胶污染是核酸检测过程中最主要且最常见污染，也是困扰绝大多数实验室的一个难题，如果不加以重视，气溶胶会污染整个实验室，严重时可导致实验室不能正常运行。该文在核酸检测防污染方面进行初步总结。

[关键词] 防污措施；核酸检测；气溶胶污染

[中图分类号] R331 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2018）09（b）-0144-02

到2015年，血液核酸筛查检测基本覆盖全国[1]。核酸检测反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但在操作过程中易受到污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。该站核酸实验室运行至今已完成了将近27万人次的核酸样本检测，在核酸检测防污染方面积累了一定的工作经验，现报道如下。

1 布局合理的实验室是保证实验能正常进行的前提

该站核酸实验室按工作需要分为：试剂储存区（一区）、样本处理区（二区）、扩增区（三区），各区均设有缓冲间。各区在空间上完全独立，不能相通。各区有独立的通风系统，一、二、三区压力依次递减，一区、二区保持正压，三区保持负压状态，各区间压差≥5 Pa，二区、三区可适当加大压差。进风口和出风口不能设在建筑的同一平面，要避免排出的空气被重新吸进实验室。各区域只用于特定的操作，工作衣和清洁消毒物品不得跨区混用，实验室人员和物品应按照从一区→二区→三区的单向工作流向制度，不得逆向流动。

2 质量控制

实验室应建立合理、科学的室内质控标准操作规程（SOP），根据检测模式的不同选择不同的质控方法和质控规则，且质控应从样本处理到报告发放全程参与，对每一批检测至少设立一组质控品，并包括至少一个弱阳性室内质控品。

2.1 人员和培训

真正决定工作质量的关键是人。防污染的关键是工作人员安全的操作行为和严格执行标准操作规程。实验室人员配备应该符合核酸检测工作量的要求，岗位设置与选择的检测系统和检测策略配合一直，工作人员需要通过相关的质量管理规范要求，定期参加核酸检测技术培训并合格，定期为实验室人员进行时长不低于1 W的核酸理论和实际操作专项培训。

2.2 试剂的储存

相对于酶免疫试剂，核酸检测试剂种类多样，且对温度敏感，分别要求于-20℃、-4℃～8℃及常温25℃环境中，故在接收试剂时需要对其进行严格的运输温度检查以及到货是质量检查，确认不同种类试剂在运输过程中的温度控制是否满足说明书要求，试剂是否有破损，是否存在外包装标识或者条码不完整等情况。在储存时，试剂储存区仅用于核酸试剂和耗材的存储，是核酸扩增实验室最为“洁净”的区域，不应有任何核酸的存在。核酸质控品和试剂盒中的阳性对照不能进入试剂储存区，可存放于样本处理区冷冻保存[2]。

2.3 标本的采集

在影响血液筛查结果的众多因素中，标本因素是首要的[3]。用于核酸检测实验的采血管必须采用无菌、无DNA酶、无RNA酶、带惰性分离胶、一次性使用的EDTA-K2抗凝真空采血管，采血管应无裂痕，无渗漏[4]。标本采集过程中若遇采血管负压不足，应更换一支采血管重新留样，标记后两管同时送检。严禁开帽留样，以防外界酶及抑制物进入标本，影响检测结果。

2.4 样本的处理

①尽量减少开盖样本在实验室环境中的暴露时间。实验开始前在生物安全柜或正压环境中使用全自动开盖系统或手工开盖，加样结束后，立即使用一次性使用的硅胶塞或试管帽对样本密封，避免未知核酸阳性样本对阴性样本的污染，从而影响拆分结果。

②实验过程中避免在已开盖的样本上方活动，以免抑制物进入标本，导致假阴性。

③检测后核酸样本放置在冰箱指定位置暂存，经高压蒸汽灭菌器消毒处理后按医疗废物處置。

2.5 阴、阳性对照和质控品的配制

设立阴、阳性对照有利于监测反应体系各成份的污染情况。但阳性对照和质控品在核酸提取设备中混匀、振荡时会产生气溶胶或液滴溅出，成为潜在的污染源。核酸实验室阴、阳性对照的配制及质控标准品的复融、混匀、开盖均应在生物安全柜中进行。为防止阳性对照和质控品对标本造成污染，应在标本全部上机后，再配制阴、阳性对照和质控品[5]。阳性对照及质控品复融后应先确认各管帽已拧紧，上下颠倒混匀时液体不会溅出或漏出，混匀后离心，把管壁和管帽上的液体收集于管底，防止开盖时液体溅出污染生物安全柜。开盖后在生物安全柜内静置5 s以上，待管内产生的气溶胶经生物安全柜抽滤清除后再转移至样本架。

2.6 试剂配制及耗材摆放

试剂和耗材均属于洁净无污染的实验物品，使用前认真检查试剂和耗材外观，应无破损、渗漏等。配制试剂时应正确使用加样器，吸样时，应缓慢匀速，避免液体溅到加样器头上，尽量一次性吸完，忌反复多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶。打出液体后拇指不应松开按钮，应先将吸嘴压掉再将拇指松开，避免液体回吸[6]。核酸提取结束后，取下废弃试剂和耗材，用自封袋密封后放入医疗废物桶中。

2.7 核酸扩增

扩增产物是最容易出现的污染，通常一次典型的PCR扩增可以产生109拷贝的靶序列，若气溶胶化，最小的气溶胶都会含106拷贝的扩增序列，这些气溶胶的累积会污染实验室内的试剂、仪器设备和通风设备，使检测结果出现异常[7]。因此，应对核酸扩增的每一个环节进行严格的规范操作。

①扩增反应液和样本核酸模板分装完毕检查管内液面高度一致后，加盖八联管盖，逐孔按紧，混匀离心后再次检查八联管有无渗漏。

②八联管转移至96孔扩增盘时再次确认管盖已封严，以防扩增过程中爆管导致实验室污染[8]。

③扩增结束后要及时将扩增产物从扩增仪里取出（禁止打开八联管），检查管内液面无变化后放入自封袋内封严，然后带出扩增区，按医疗废物处理。每次扩增后，可使用可移动紫外灯对扩增热循环仪进行照射。

2.8 實验结束后的清洁消毒

清洁消毒方法不当也是实验室污染的一个主要原因，实验结束后应遵从先清洁区域后污染区域消毒的原则，及时对实验室空气、设备表面、工作台面和地面等实施有效的消毒。核酸实验室不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防交叉污染。先用75%酒精对实验室空气进行密集喷淋，以对实验过程中产生的气溶胶产生较好的沉降效果。喷淋结束立即采用500 mg/L的84液擦拭工作台面/拖擦地面，作用10 min后用清水擦拭工作台面，以防止84液残留抑制实验结果；设备表面用一次性洁净纱布沾取75%酒精擦拭消毒。擦拭消毒结束工作人员离开实验室，打开实验室各处的紫外灯和紫外灯车对实验室空气和台面照射消毒，照射时间≥1 h。

2.9 仪器和设备

应该给予实验室配备满足检验工作需要的相关核算检测系统、混样仪、生物安全柜、离心机、样品开盖机、冷藏冷冻、不间断电源（UPS）、消毒柜等基本设备，并且在系统及设备安装、运行过程中对其及逆行效能、交叉污染、稳定性检测，在厂家提供的操作说明书的基础上，制定检测过程中或者日维护、周维护、月维护和校准验证计划，确保设备正常有效运行。

3 其它方面

3.1 每个月对实验室进行环境监测

监测实验室是否存在污染，清洁消毒效果是否良好。可使用擦拭法对冰箱门把手、实验室门把手、实验室台面、生物安全柜、设备台面、传递窗等部位进行监测，用空气沉降法对实验室各区空气质量进行监测。任一方法/部位环境监测结果不合格，均应采取相应措施加强实验室清洁消毒，直至环境监测结果全部合格。

3.2 实验室温、湿度控制

相对条件下，气溶胶浓度与温度是负相关，与湿度成正相关[7]，可在规范要求范围内合理控制实验室温度、湿度的波动范围，减少气溶胶的产生。

3.3 防护措施

实验过程中必须穿戴工作衣、帽、口罩，戴一次性无粉手套，疑有污染立即更换。

3.4 消毒设备

紫外灯管累计工作1 000 h或辐射强度低于70 μW/cm2时应更换灯管。

3.5 对仪器设备的辅助用品如离心机，离心杯，试管架，手推车等定期进行消毒

核酸检测实验室防污染措施可结合实验过程中的具体操作方法以达到最佳效果，措施包括但不仅限于上面几种。细节决定成败，尤其对于实验环境和操作要求极高的核酸实验室，任何一个环节做不好都可能影响整个实验结果。因此，操作人员应具有“无核酸”“无基因”概念[9]，把防污染思想贯穿于整个实验过程中，严格遵守操作规程，保证检测质量，确保临床用血安全。

[参考文献]

[1] 林松峰.核酸实验室温湿度控制、清洁消毒及防污染措施[J].医疗装备，2016，29（22）：43-44.

[2] 陈越康，李活，王飞，等.核酸筛查实验室RNA酶污染防止对策探讨[J].中国自然医学杂志，2007，9（2）：137-138.

[3] 余霖，陈庆恺，何子毅.核酸检测应注意的几个问题[J].临床输血与检验，2017，19（5）：528-529，536.

[4] 国家卫生计生委.血站技术操作规程（2015版）（Z），2015-12-17.

[5] 李园.PCR实验室的消毒与防污染措施[J].检验医学与临床，2010，7（3）：285-286.

[6] 李金明.实时荧光PCR技术[M].北京.人民军医出版社，2014.

[7] 倪沈阳，石巍，陈琬玥，等.温湿度对气溶胶浓度影响的模拟研究[J].吉林建筑大学学报，2016，33（6）：53-56.

[8] 蔡丽娜，陈宝安.核酸扩增技术（NAT）在献血者血液初筛中的应用现状[J].中国实验血液学杂志，2014，22（4）：1171-1177.

[9] 冷婵，王中梅，于磊，等.血站核酸检测实验室风险识别、评估及控制方法探讨[J].中国输血杂志，2011，24（7）：547-550.

（收稿日期：2018-06-19）