黑龙江地区农田害鼠发生特点及DNA条形码鉴定技术的应用

2018-05-14李争光丛林王大伟

植物保护 2018年6期

李争光丛林王大伟

摘要黑龙江地区为我国最大的商品粮生产基地之一，鼠害是影响该地区粮食生产的重要因素之一。为了解当地农田害鼠种类、密度及分布特征，本研究于2010-2011年对该省主要作物田的啮齿类动物开展调查，并利用细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基（cytochrome C oxidase subunit Ⅰ，COⅠ）对害鼠种类进行鉴定，分析该地区农田害鼠种类分布和发生特点，为其防治提供基础数据和方法依据。结果表明，所捕获的害鼠经形态鉴定可分为2科7属7种，分别为鼠科的黑线姬鼠、巢鼠、褐家鼠和小家鼠，以及仓鼠科的大仓鼠、黑线仓鼠和东方田鼠。DNA条形码分类结果与形态分类结果一致，但是在近缘种间的区分上还需要与形态数据相结合。黑龙江地区农田害鼠密度呈现出“春低秋高” 的时间特征，并且在玉米田中最高；在鼠种特征上，黑线姬鼠为广布种和优势种，其他鼠种则在局部地区密度较高。根据上述结果，应将春季作为黑龙江地区农田害鼠的重点防治时期，重点作物为玉米，同时应重点关注大中型鼠的数量变动情况。

关键词黑龙江省；农田害鼠； DNA条形码；物种鉴定；分布特征

中图分类号： S 443

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018001

Abstract Heilongjiang Province is the largest commodity grain base of China， and huge damage caused by pest rodents is a key factor affecting local crop production. However， few studies were conducted to investigate the basic characteristics of local pest rodents including taxonomy， distribution and population density in the agricultural areas in Heilongjiang Province. In this study， we surveyed pest rodents from six sites covering three kinds of typical crop farming regions in Heilongjiang Province， and identified the species using DNA barcoding （cytochromeCOⅠ gene）. Seven species were identified belonging to seven genera of 2 families by both DNA barcoding and morphological characterization， includingApodemus agrarius，Microtus fortis， Mus musculus， Tscherskia triton， Cricetulus barabensis， Micromys minutus，andRattus norvegicus. Among them，A. agrariusis the dominant species and widely distributes in whole province. Compared with the population density in spring， it was significant higher in autumn， indicating the overt seasonal breeding of local rodents. Moreover， the population density in maize farmland was higher than that in rice and soybean ones. Therefore， rodent management in Heilongjiang Province should be focused on spring season， maize farmlands， and the rodent species with middle or large body size， such as hamsters and Norway rat.

Key words Heilongjiang Province； pest rodent in farmland； DNA barcoding； species identification； distribution characteristics

鼠害是世界范圍内常见农业灾害之一，给农、林、牧业都带来了巨大的损失。20世纪80-90年代是我国鼠害发生最严重的时期，全国农业鼠害发生省份最多可达27个，发生面积近2 467万hm.2，约占全国耕地总面积的24.6%，粮食损失最高超过1 500万t/年[1]。近10年来，全国农区鼠害发生维持在中等至中等偏重趋势，东北地区农田鼠害发生则常年保持在偏重状态[2-7]。随着种植结构调整，东北地区已经成为我国最大的商品粮生产基地。黑龙江省地处我国最北端，耕地面积超过1 300万hm.2，人均耕地面积0.31 hm.2，位居全国之首。早在20世纪50-60年代就有关于黑龙江林区和平原鼠类研究的报道[9-11]，但专门针对农田鼠害的研究在近几年才逐步受到重视[12-14]。已有学者对东北地区啮齿动物种类和区系进行了研究[13-18]，然而针对黑龙江地区农田害鼠的主要种类及其发生和分布特征研究的较少，对其主要鼠种特征及发生规律尚不明确。

DNA条形码技术是指用DNA上一段标准的小DNA片段来鉴定物种的一项分子鉴定技术，最早由Hebert等在2003年提出，被广泛用于物种的鉴定，尤其是对于形态相似的近缘种[19]。目前广泛用于动物条形码研究的分子标记主要是线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ （cytochrome C oxidase subunit Ⅰ，COⅠ）[20-26]。该技术也被广泛用于啮齿类动物的鉴定和检验检疫。利用COⅠ 作为DNA条形码，刘润吉等[20-21]在贵州茂兰和黑龙江黑瞎子岛两地对当地主要害鼠种类进行鉴定，有效区分出外形相似的鼠种；闫东等[23]鉴定了河北省鼠疫疫源的主要鼠种；普丽娅等[24]将来自津巴布韦的集装箱内的鼠类残骸鉴定为黑鼠Rattus rattus。这些研究表明，DNA条形码技术是形态学鉴定的有力补充。

因此，本研究重点调查了黑龙江各主要农区鼠类发生情况，结合DNA条形码技术进行种类鉴定，并分析农田害鼠发生和分布的时空特征，以期阐明黑龙江地区农田害鼠分布和发生情况，为当地农田害鼠防治提供基础数据和防治依据。

1 材料与方法

1.1 鼠类样品采集

本研究调查覆盖黑龙江各主要农区，包括东部三江平原农作区（佳木斯市富锦市）、中部山区农作区（哈尔滨市双城区、哈尔滨市道外区、哈尔滨市尚志市）和西部松嫩平原农作区（大庆市杜蒙县、绥化市北林区）。铗捕率调查主要采用“铗夜法”，在秋季水稻田中则采用“尽捕法”。铗夜法根据农业行业标准NY/T 1481-2007《农区鼠害监测技术规范》要求，在样地邻近地块进行铗线法，将中号鼠铗（140 mm×55 mm）按5 m一铗布于农田边缘，次日清晨收铗，记录捕获的害鼠种类及其数量；尽捕法则利用自制工具将从稻堆中逃出的老鼠处死，记录数量、种类[12]。2010-2011年调查地点经纬度及生境情况见表1。

1.2 形态鉴定

在现场根据外部形态特征进行初步鉴定，将获得标本冷冻后带回实验室测量外部形态，制作头骨并对头骨形态进行观察和测量，根据检索表[15]对形態鉴定结果进行确认。

1.3 DNA条形码分析及鉴定

1.3.1 基因组DNA提取及PCR

利用TIANamp Genomic DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取鼠类脚趾或尾巴的DNA，-20℃保存备用。

1.3.2 PCR扩增与测序

设计通用引物（BatL5310，R6036R）[27]扩增每个样本的COⅠ基因片段。PCR反应体系为：25 μL体系，Mix 12.5 μL，引物各0.5 μL，模板1.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性45 s，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸10 min。PCR扩增产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，利用Illumina 3730测序仪进行双向测序。

1.3.3 DNA序列分析

釆用Lasergene 7.0软件查看测序结果的峰图，对序列进行人工校正[28]；再用DnaSP 5.0软件分析变异位点数目，并对序列进行单倍型分析[29]。最后用MEGA 7.0软件中基于Kimura-2-parameter（K-2-P）的遗传距离用邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树，重复检验值（bootstrap）设置为1 000，并比较不同鼠类种群内和种群间个体的遗传距离[30-33]。以三趾跳鼠Dipus sagitta（NCBI 登录号NC_027499.1）的COⅠ序列作为外类群。

1.4 农田鼠类发生规律分析

根据形态学和条形码鉴定结果，统计黑龙江省6个地区（佳木斯市富锦市长安镇、哈尔滨市双城区红旗乡、哈尔滨市道外区民主乡、哈尔滨市尚志市帽儿山镇、大庆市杜蒙县一心乡和绥化市北林区白魁镇）不同害鼠种类在春季和秋季的铗捕率，分析不同鼠类的季节性发生特征；分析不同作物（大豆、玉米和水稻）田间鼠类的优势种类以及鼠在不同作物田间的分布特点。

2 结果与分析

2.1 各地农田鼠形态鉴定

在6个地区共采集完整鼠类样品340只，形态鉴定为2科7属7种，分属于鼠科中的姬鼠属、巢鼠属、大鼠属、小鼠属，以及仓鼠科中的大仓鼠属、仓鼠属、田鼠属（表2）。

2.2 DNA条形码分析

从收集的340只鼠类样品中挑选来自7个属7个种112只鼠进行COⅠ序列扩增和测序。对获得的112条序列进行比对分析发现220个变异位点（variable sites），其中216个是系统发育信息位点（parsimony informative sites）。单倍型分析表明112个COⅠ序列中有41个不同的单倍型。将其与NCBI中的参考序列进行比对分析表明，其分属于7个鼠种，与对应物种的相似性 >98%。进一步利用MEGA软件分析所采集样本不同鼠种间和种内的遗传距离（genetic distance），结果表明7个鼠种的种间遗传距离（16.17%～25.21%）远远大于种内遗传距离（0.22%～2.69%）。（表3）

利用邻接法（neighbor-joining）对41个COⅠ序列单倍型进行系统发育分析表明，同一种的鼠类聚为一支，支持率均为100%（图1）。整个系统树分为3个明显的大支，其中鼠科一支的支持率为54%，包括黑线姬鼠、巢鼠、褐家鼠、小家鼠；第二大支的支持率为93%，包含仓鼠科中的大仓鼠、黑线仓鼠；来自仓鼠科中田鼠亚科的东方田鼠单独聚为一支，支持率为100%。（图1）

2.3 黑龙江农田害鼠发生规律分析

2.3.1 季节规律

对黑龙江地区春秋两季的铗捕数据进行统计后发现，春季（5-6月）收回有效铗1 380个，共捕到鼠83只，铗捕率为6.0%，秋季（9-11月）收回有效铗1 924个，共捕到鼠375只，铗捕率为19.5%。秋季铗捕率大约为春季铗捕率的3倍以上，呈现出“秋高春低”的时间分布特征。

2.3.2 分布特点及优势鼠种分析

采用秋季铗捕数据分析表明：在不同的农作物间，玉米田中铗捕率最高，为25.1%，大豆田次之，为15.3%，水稻田最低，为12.1%；玉米田中铗捕率可达其他两种作物的2倍左右。黑线姬鼠为各种农田中的绝对优势种，在3种作物田占样本数比例均达到60%以上；褐家鼠在3种作物田中均有分布，且数量较为稳定，在10%左右；东方田鼠主要分布在水稻田，高达20%，远远大于其他两种作物田的密度；大仓鼠主要分布于大豆和玉米田；小家鼠及黑线仓鼠则在3种作物田里极少分布，均不超过5%（表4）。

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