海洋红酵母的酶法破壁及在发酵鸡饲料中的应用

岳 春,姚 虹,李靖靖,初 峰

(1.南阳理工学院 生物与化学工程学院，河南 南阳 473004；2.郑州工程技术学院 化工食品学院，郑州 450044)

海洋红酵母是自然海域中存在的一种酵母菌，其细胞中富含蛋白质、肝糖、不饱和脂肪酸、动物幼体生长激素及以虾青素为主的类胡萝卜素等多种营养物质。随着水产养殖业的蓬勃发展，海洋红酵母已经被广泛选用为海参、虾、蟹、贝的幼体浮游期的鲜活饵料。[1]研究表明，海洋红酵母能显著提高幼苗的存活率、饲养效果和饲料报酬率，并能增强动物体的免疫功能，减少抗生素用量，是生态养殖的优良添加剂。[2]目前国内的饲料主要以传统的蛋白饲料为主，还停留在较低水平。近年来国内有厂家开始工业化试生产红酵母饲料，国外已用于饲料添加剂中，[3-4]但类胡萝素是红酵母细胞内产物，破壁效果及提取方法直接影响红酵母发酵生产类胡萝素的产量、质量和生产成本。[5]因此，研究红酵母破壁方法具有重要意义。

海洋红酵母的破壁方法有很多，目前研究较多的是化学法，但化学法破壁条件苛刻，并有可能改变虾青素的理化性质。酶法破壁近年才开始研究，条件温和，能很好的避免虾青素等多种营养物质被破坏，并有利于提取。温和的化学渗透剂可以改变酵母细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择地渗透出来并保持活性不变。[6]

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

海洋红酵母菌种：南阳理工学院实验室保存；发酵鸡饲料：实验室自制；β-甘露聚糖酶：湖北佳诺信生物化工有限公司，酶活力为50000U/g；蛋白胨：博欧特(天津)化工贸易有限公司；酵母膏：河南三顺教学仪器有限公司； 葡萄糖：北京鹏彩精细化工有限公司；硫酸镁、氯化钠、硫酸铜、硫酸钾：上海埃彼化学试剂有限公司；磷酸氢二钾、二甲基亚砜：德州市富凯化工有限责任公司；丙酮：南京化学试剂有限公司；浓硫酸、硼酸：天津赛孚瑞科技有限公司。

1.2 仪器与设备

BPX-82型电热恒温培养箱：上海科晓科学仪器有限公司；DK-98-1型恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；101-2A型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；PHS-3B 型精密pH计：上海雷诺仪器厂；BS 100 S型电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；YX-280A型高压灭菌锅：南京市科立华仪器仪表有限公司；TGL-20B型台式离心机：上海沉黄科学仪器有限公司；HZQ-X100A型恒温培养震荡箱：南京晓晓仪器设备有限公司；WF2-2000型721分光光度计：上海龙尼柯仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基的制备

(1)斜面活化培养基：葡萄糖25.0g/L，蛋白陈8.0g/L，酵母粉5.0g/L，琼脂20.0g/L，pH 5.0。

(2)液体种子培养基：葡萄糖25.0g/L，蛋白陈8.0g/L，酵母粉5.0g/L，磷酸二氢钾 5.6g/L，氯化钠 10.0g/L，硫酸镁3.0g/L，pH 4.8～5.0。

(3)发酵培养基：葡萄糖25.0g/L，蛋白陈8.0g/L，酵母粉5.0g/L，磷酸二氢钾5.6g/L，氯化钠10.0g/L，硫酸镁3.0g/L，pH 4.8～5.0。

pH由缓冲剂来调节，各种培养基经过121℃，30min灭菌后冷却至常温备用。

1.3.2 菌株的培养[7]

(1)菌株活化

将保藏于冰箱中的菌种接种在上述斜面培养基上，于30℃活化48h。

(2)种子培养

从斜面接2环到装量为50mL/250 mL三角瓶中,于28℃,300r/min离心培养24h。

(3)发酵培养

以10%接种量接入与种子培养基相同的培养基中,装量50mL/250 mL,于30 ℃,300 r/min培养72h。

1.3.3 加酶破壁

称取一定量β-甘露聚糖酶，将其溶于无菌水中配成溶液,将酶溶液加入发酵培养一定时间后的摇瓶中,然后在300r/min转速下旋转振荡一定时间。[8]

1.3.4 分析测定方法

(1)蛋白质含量的测定：凯氏定氮法(测定饲料中蛋白质的含量)。

(2)类胡萝卜素总量的测定：二甲基亚砜(DMSO)法[9]。

(3)破壁率的测定[10]：取4mL发酵液,离心后用去离子水洗涤离心3次,加10mL丙酮直接提取,4000r/min转速下离心10 min,上清液在480nm处以丙酮为空白测定吸光度Aa。酵母破壁率计算式为：酵母破壁率=Aa/A×100%。

1.3.5 单因素试验设计

考虑不同的加酶量、酶解时间、酶解温度、pH对细胞破壁率的影响。

1.3.6 正交试验设计

以破壁率为考察指标，采用L9(34)正交表进行三因素三水平正交试验，根据单因素试验的结果选择酶解时间、酶解温度、加酶量三个因素进行正交试验,筛选出最佳的因素水平。正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.4 应用[11-12]

(1)发酵饲料的准备：通过计算，称取一定量的发酵饲料。

(2)添加破壁酵母：按照最优条件对海洋红酵母进行破壁，将破壁后的酵母按照一定比例添加于发酵饲料中，制成高蛋白、含类胡萝卜素的饲料，并测定其中蛋白质和类胡萝卜素的含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果及分析

2.1.1 加酶量对甘露聚糖酶酶解效果的影响

分别称取0.01g，0.02g，0.03g，0.05g，0.07g的酶，依次装入试管中加入等量的无菌水配制成溶液，然后分别加入到发酵培养72h的发酵液中，放入摇床中在50℃，300r/min条件下酶解5h，之后取出将三角瓶放置在沸水浴中灭酶活，测吸光度,计算破壁率。加酶量对海洋红酵母破壁率的影响如图1所示。

图1 加酶量对破壁效果的影响

由图1可以看出，随着加酶量的增多，吸光度和破壁率也随之提高，当加酶量大于0.05g之后，吸光度和破壁率增加的趋势变小。可能是因为底物浓度一定，酶解程度近乎达到完全，环境的改变也可能在一定程度上影响酶的作用，所以当酶量达到一定值后吸光度和破壁率不再随之增加。故最佳酶量选择0.05g为宜。

2.1.2 酶解时间对甘露聚糖酶酶解效果的影响

将海洋红酵母发酵培养72h后，分别加入β-甘露聚糖酶0.05g，于300r/min，50℃条件下振荡酶解2h，4h，5h，6h，8h后在沸水浴中进行灭酶活，测定发酵液的吸光度，计算破壁率，结果见表2和图2。

表2 不同酶解时间下的测定结果

图2 酶解时间对破壁效果的影响

由图2可以看出，在β-甘露聚糖酶水解海洋红酵母发酵液的过程中，随着β-甘露聚糖酶水解时间的增加，吸光度和破壁率也随之增加，当水解6h后含量继续增加，但随着时间的延长，增加趋势变小，可能是因为酶的水解作用已达完全。因此，选择6h左右为最佳酶解时间。

2.1.3 酶解温度对甘露聚糖酶酶解效果的影响

将海洋红酵母发酵培养72h后，加入β-甘露聚糖酶0.05g，分别于30℃，40℃，45℃，50℃，55℃和60℃水解6h，迅速取出放在沸水浴中灭酶活，经过离心，提取，测定上清液的吸光度，计算破壁率，结果见表3和图3。

表3 不同酶解温度下的测定结果

图3 酶解温度对破壁效果的影响

由图3可以看出，50℃时海洋红酵母的破壁率最高，可能是因为当温度逐渐升高到50℃时，温度逐渐接近酶的最适温度，所以甘露聚糖酶的破壁率逐渐升高，但随着温度升高，由于酶慢慢失去活性，酶解效果减弱，故破壁率呈下降趋势。因此，酶解温度选择50℃左右较适宜。

2.1.4 pH对破壁效果的影响

按照0.05g加酶量在50℃酶解温度下，分别调整发酵液的pH，震荡酶解6h。测定结果和酶解曲线分别见表4和图4。

表4 不同pH下的测定结果

由图4曲线可知，pH4～5时，破壁率随pH的上升而增加，pH大于5时，细胞破壁率随pH上升而下降，应该是因为pH接近5时逐渐接近甘露聚糖酶的最适pH，此时酶活力比较高，而当pH继续增大，环境的改变使酶不再适应，酶活力也降低，所以破壁率随pH增大而下降。因此，酶解pH取5左右为佳。

2.2 甘露聚糖酶酶解海洋红酵母条件的优化结果与分析

根据1.3.6的方法在单因素试验的基础上进行正交试验设计[12]。

2.2.1 正交试验结果与极差分析

采用L9(34)表设计试验，试验结果及极差分析见表5和图5。

图5 因素与指标趋势图

由表5可以看出，对于A因素而言，k1>k2>k3,由于破壁率是越大越好，所A1为A因素的最优水平；对于B因素而言，k2>k1>k3，所以B2为B因素的最优水平；对于C因素而言，k2>k3>k1,即C2为C因素的最优水平。故本试验的最优水平组合为A1B2C2，即甘露聚糖酶酶解海洋红酵母的最佳条件为加酶量0.05g，酶解温度50℃，酶解时间6h。

表5 正交试验结果

由极差分析以及因素与指标趋势图可以得出，RC>RB>RA，各因素对破壁率影响的主次顺序为C>B>A，即加酶量的影响最大，其次是酶解温度和酶解时间。

2.2.2 正交试验设计方差分析

通过计算进行显著性检验，列出方差分析表，结果由SPSS软件得出，结果见表6。

表6 方差分析表

由表6可见，因素C最显著，A和B均不显著，各因素对试验结果的影响主次顺序为C>B>A。

2.2.3 正交试验小结

通过对正交试验结果的极差分析和方差分析，可见试验结果一致。加酶量为主要的影响因素,不同的加酶量对海洋红酵母细胞壁的破壁率影响最大,最合适的加酶量为0.05g；酶解温度的变化对红酵母破壁率的影响次之,以50℃为最好；酶解时间的变化对海洋红酵母破壁率的影响最小,以6h为最佳。通过正交试验的优化组合,得到海洋红酵母菌细胞酶法破壁的最优条件:50mL海洋红酵母培养液发酵培养72h，加酶量为0.05g，酶解温度为50℃,酶解时间为5h，pH为5，摇床300r/min。在此优化的培养条件下,海洋红酵母的破壁率可达81.25%。

2.3 最优条件在发酵饲料中的应用

根据以上正交试验所得最佳海洋红酵母破壁条件，将制备的50mL破壁海洋红酵母培养液直接加入到50g饲料中混匀，然后将其烘干，测定蛋白质含量与类胡萝卜素含量，结果见表7。

表7 测定结果

由表7可知，添加酵母后可明显增加蛋白质含量，在一定程度上也增加了类胡萝卜素的含量，试验条件可行。

2.4 应用分析与讨论

由以上试验结果可知，在试验条件下，的确能增加蛋白质和类胡萝卜素含量，但是在实际应用时还应进一步验证，主要有以下几个问题：

(1)本试验目的是提高红酵母在饲料中的利用率，即破坏酵母细胞壁，使细胞内类胡萝卜素释放，最终增加畜禽产品的感官色泽与营养价值。关于本试验的结论最终应用结果如何，添加多少能达到最好效果，还要在饲喂之后才能最终定论。

(2)试验与实际应用的量之间还有很大的差别。试验是短时的，实际应用中更要考虑饲料的成本问题，以及饲料本身的保藏问题。

(3)最终符合要求的饲料中的添加量，还需要在实际应用中探究。

(4)本试验采用的是甘露聚糖酶酶解的方法，但是酵母细胞壁中含有少量蛋白，试验中并未用到蛋白酶。考虑原因：其一，饲料本身原料中有豆粕，大豆蛋白比较多，蛋白酶的加入会使其水解，容易出现苦味，从而影响饲料本身的风味。虽然有一定的方法掩盖苦味，但方法比较复杂，另外还需要进一步考虑成本问题。其二，加入蛋白酶虽然在一定程度上能提高氨基酸的含量，并且能提高消化率，但是氨基酸产品不容易保藏。

3 结论

本试验以实验室保藏海洋红酵母为菌种，采用酶法对海洋红酵母进行细胞破壁，通过对影响破壁条件的几个因素(加酶量、酶解时间、酶解温度、pH)的单因素研究，采用正交试验得出较佳的酶解条件组合，并将其添加到发酵鸡饲料中，通过分析测定蛋白质的含量，来确定破壁海洋红酵母在饲料中的应用效果。具体结论如下：

(1)通过正交试验得出最佳酶解条件：海洋红酵母发酵培养72h，加酶量为0.05g，酶解温度为50℃,酶解时间为6h，摇床300r/min。在此条件下,海洋红酵母的破壁率可达81.25%。

(2)按照以上条件所制得的破壁酵母，将其加入到发酵饲料中，加入之前饲料蛋白含量为25%左右，加入之后蛋白含量为45%左右，比之前蛋白含量提高了20%。

(3)本方法不仅增加了饲料蛋白质含量，提高了饲料的营养价值，同时也增加了类胡萝卜素的含量，测得类胡萝卜素的含量为11.56μg/g。

参考文献：

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