Ala -Gln二肽代替Gln提高绵羊体外受精胚胎发育能力试验*

张奇波，皮文辉*

（1.克拉玛依绿成农业开发有限公司，新疆 克拉玛依 834000；2.省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室/新疆农垦科学院畜牧兽医研究所）

L-谷氨酰胺（Glutamine，Gln）是生物合成核酸的必须前体物质，是蛋白质合成与分解的调节物，是体内外早起胚胎发育的必须氨基酸[1-8]。Gln在哺乳动物雌性生殖道子宫液中呈现较高生理浓度[1-4]。Gln添加改善了哺乳动物小鼠、人、猪和牛的胚胎体外发育率[5-8]。

胚胎体外培养37℃环境中，氨基酸的代谢和氨基酸自然分解会释放铵离子 （ammonium，NH4+）进入胚胎的周围环境中[9]。小鼠和家畜早起胚胎体外培养研究显示，由于铵的存在，胚胎的生理、发育和生存能力受到损害[9-12]，甚至影响出生个体健康状态[9]。降低培养液氨基酸浓度或改变氨基酸形式，降低铵的蓄积，有利于改善胚胎发育环境[9，13]。

哺乳动物胚胎体外培养液添加Gln浓度一般是1 mmol/L或2 mmol/L。然而Gln化学稳定性差，会自然降解成铵和5-吡咯烷酮-2-羧酸 （5-pyrrolidone-2-carboxylic acid）[14]。用含 Gln 的二肽代替培养液中的Gln，能够避免Gln自然分解产生的铵，降低培养液中铵的累积程度[9]。商品化的人用移植前胚胎培养液已经采用Gly-Gln （glycyl-L-glutamine）或 Ala-Gln（Alanyl-L-Glutamine）二肽代替 Gln[15]。Gln 二肽改善了小鼠[9，16，17]、猪[18-19]早期胚胎体外发育能力。

在含氨基酸的培养液中，绵羊囊胚培养产铵量显著高于小鼠囊胚，间接表明反刍动物胚胎比啮齿类胚胎需要代谢利用更多的氨基酸[20]。利用二肽代替Gln，降低培养液中铵的累积量，可能对绵羊胚胎体外培养产生积极影响。

1 材料和方法

1.1 卵母细胞体外成熟

将屠宰场获得的绵羊卵巢放在装有生理盐水的保温瓶中，2～4 h带回实验室。剪去卵巢周围多余组织，用生理盐水清洗2遍，带入无菌间进行采卵。镊子夹取卵巢置于采卵液 （M199+0.1%BSA+0.1 mg/mL肝素+0.1 mg/mL庆大霉素）中，用无菌手术刀片将卵泡切开。卵巢切割完成后，用手拉玻璃细管在体式显微镜下选取形态正常、胞质均匀的卵丘卵母细胞复合体进行成熟。1 mL成熟液中 （M199+15%FBS+0.1 IU/mL FSH+0.2 IU/mL LH+1.0 μg/mL雌二醇）培养80枚/mL，培养条件为38.5℃、5%CO2、饱和湿度，成熟培养24 h。

1.2 卵母细胞体外受精

Percoll梯度离心法处理绵羊精液：从液氮罐中取出绵羊细管冷冻精液，放入39℃水浴解冻。用HSOF液配制90%和45%的Percoll梯度溶液，将解冻后的冷冻精液轻轻加在Percoll梯度液的表面，进行密度梯度离心（500 g 或 2 000 r/min，20 min）。沉淀精子再用5 mL HSOF（SOF+20 mmol/LHEPES+5 mmol/LNaHCO3+0.3%BSA）离心洗涤 （300 g或1 200 r/min，5 min）1次，去上清液后，用受精液将精子密度稀释至5×106个/mL用于体外受精。

受精前1～2 h在培养皿做好受精液小滴，每滴70 μL，覆盖石蜡油，放入 CO2培养箱中平衡。SOF液是受精基础液，添加2%（v/v）发情羊血清、2.9 mM乳酸钙和16 μM异丙（去甲）肾上腺素[21]。在精子处理的同时，用200 μL移液器在原成熟盘中反复吹打培养成熟的卵母细胞和颗粒细胞复合体，使卵子间相互分离，去除部分颗粒细胞。卵子在HSOF中洗涤3次，受精液中洗涤1次。将30～50个卵母细胞移入受精液滴中，再用移液器吸取10 μL处理后的精液，加入受精液滴中，精子的最终浓度是5×106个/mL。然后将培养皿放入38.5℃、5%CO2和饱和湿度培养箱中过夜培养。

1.3 体外发育培养

发育液是NaHCO3缓冲的SOF溶液，添加1%（V ∶V）非必须氨基酸溶液（Sigma，M7145）、2%（V ∶V）必须氨基酸溶液（Sigma，B6766）、8 mg/mL BSA（Sigma，A3311）。对照组添加 Gln 2 mmol/L，实验组添加 Ala-Gln 二肽 （Gibco，GlutaMAX 100×，35050061）2 mmol/L。受精后的合子用发育液清洗干净，100～150枚/0.5 mL发育培养液中培养，培养环境是38.5℃、5%CO2饱和湿度。整个发育培养过程不换液。分别在培养的 24 h、48 h、120 h、144 h和168 h观察，确定卵裂数、囊胚数和孵化囊胚数。

1.4 统计分析

用SPSS软件统计分析，所有数据均表示为平均数±标准误。胚胎分裂率、囊胚率和孵化囊胚率数据利用卡方检验进行分析，当P＜0.05时认为差异显著。

2 结果

2.1 Ala-Gln二肽对绵羊体外受精胚胎发育的影响

为了分析Ala-Gla二肽对绵羊体外受精胚胎发育的影响，本实验进行了7次对比实验。每次实验当天采集新鲜绵羊卵巢，从中收集质量好的卵母细胞进行体外受精，将体外受精后的合子，随机分为Ala-Gln培养组和Gln培养组进行体外发育培养。每组培养的合子控制在100～150枚。培养24 h、48 h、120 h、144 h 和 168 h，分别观察卵裂率、囊胚率和孵化囊胚率。

表1 Ala-Gln或Gln对绵羊体外受精胚胎发育的影响

统计7次实验结果并进行卡方检验。结果表明（见表1），受精卵体外培养24 h卵裂率差异不显著（23.06±3.05 VS 19.80±4.06）。42 h卵裂率（86.17±2.97 VS 82.36±4.52）差异显著。120 h和144 h的囊胚率差异显著 （17.66±1.88 VS 13.29±1.67和31.85±1.80 VS 26.37±2.44）。168h孵化囊胚率差异不显著（16.69±2.12 VS 14.90±1.95）。这些结果说明，在胚胎培养液中使用Ala-Gln代替Gln，可以有效提高绵羊胚胎在体外的发育能力。

3 讨论

实验表明，不同物种着床前的胚胎体内外发育能力都受到氨基酸的影响[1-8]。氨基酸已经成为早期胚胎发育培养液中普遍添加的成分。Garden和Lane报道，氨基酸对早期胚胎发育产生积极影响的同时，胚胎代谢氨基酸和37℃天然降解氨基酸，导致培养液中蓄积铵离子水平逐渐增加[22]。在添加必需氨基酸和非必须氨基酸，用Ala-Gln代替Gln的培养液中，两细胞阶段的胚胎，铵离子的积累几乎可以忽略不计[23]。估计小鼠和牛囊胚代谢产生铵离子的速率分别是 1.0 pmol/胚胎/h和4.3 pmol/胚胎/h[22]。牛囊胚产铵离子速率比小鼠高很多，主要是归因于代谢水平更高[24]。

Summers[25]等用Gly-L-Gln代替Gln培养小鼠胚胎，没有影响囊胚率，但刺激了内细胞数量增加，可能对胚胎质量产生有益影响。Gly-L-Gln或Ala-L-Gln代替Gln的商品化人用胚胎发育液[15]和猪[18，19]胚胎发育影响研究，都表明二肽优于Gln培养结果。

本实验表明，Ala-Gln代替Gln提高了绵羊卵母细胞体外受精卵裂率、囊胚发育率（见表1）。由于二肽化学稳定性高，商品化的Ala-Gln试剂为200 mM的液体，配制成2 mM工作浓度时，只需用移液器取适当体积溶液，不用称量。而Gln化学稳定性差，试剂以固体形式保存，每次配制时需要称量。因此，采用商品化的Ala-Gln溶液，免除了称量Gln，简化了绵羊体外受精发育液配制，改善了胚胎体外发育能力。

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