新疆巴州地区部分猪场猪伪狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗体检测与分析

马 博 卜三平

（巴音郭楞职业技术学院新疆库尔勒 841000）

伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV)是引起猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR)的病原，PRV属于疱疹病毒科（Herpesviridae）、α 疱疹病毒亚科（Alpha herpesviridae）中猪疱疹病毒Ⅰ型（Suid herpes virusⅠ）[1]。PR具有急性、热性和高度接触性传染的特点，危害严重。猪是自然界中PRV的唯一宿主[2]，猪感染PRV后能引起脑脊髓炎症、自身发热、奇痒，常引起妊娠母猪流产和仔猪死亡，且仔猪死亡率偏高[3]。PR全球范围流行，根除难度大[4]。国际兽医局（OIE）将之列为B类动物传染病，我国将之列为二类动物传染病[5-6]。20世纪90年代，西方发达国家大多制定并启动了根除PR的计划。欧洲国家和我国均采用猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体ELISA（酶联免疫吸附试验）检测法对猪群进行监测，以达预防PR和净化猪场PRV的目的[7-8]。PR于1813年最早在美国发现，1912年其被定为一种独立的疾病。我国最早报道该病是在1947年，2011年我国大面积爆发PR，给养猪业带来巨大经济损失。我国在《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》中将PR列为优先防治的动物疫病之一，也是种畜禽净化的重点疫病之一，规划中提到到2020年我国所有种猪场PR都要达到净化标准。该病在临床上可用血清学方法进行诊断，如ELISA、中和试验、补体结合试验等，因ELISA具有操作快速简便、敏感性高、特异性强等突出优点而被广泛使用。

巴音郭楞蒙古自治州（简称巴州），为新疆维吾尔自治区下辖州，位于新疆维吾尔自治区东南部，全州在加快畜牧业的发展上做了大量工作，生猪养殖是巴州畜牧业发展的一个重要方向。2016—2017年期间，为调查新疆巴州地区猪群PRV野毒感染情况，本试验从巴州地区的18个规模化猪场（库尔勒市、轮台县、尉犁县、和硕县、若羌县、焉耆县、和静县、且末县、博湖县）采集血样865份，采用间接ELISA方法检测PRV-gE蛋白抗体情况。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 血样采集

2016—2017年期间，从巴州地区的18个规模化猪场（库尔勒市、轮台县、尉犁县、和硕县、若羌县、焉耆县、和静县、且末县、博湖县）的不同年龄阶段猪群（0～10日龄仔猪、11～20日龄仔猪、21～30日龄仔猪、后备母猪、经产母猪、种公猪）共采血样865份。

1.1.2 试验仪器和材料

猪伪狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗体检测试剂盒（武汉某生物公司）、移液枪、恒温培养箱、自动酶标仪（美国BioTek公司）、10 mL兽用采血器、震荡仪、计时器、烧杯、锥形瓶等。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集

规范地使用采血器从猪的前腔静脉采血3～4 mL/头，待血清析出后，将血样放到保温箱内（有冰袋）带回实验室。每份移取1 mL血清到灭菌后的EP管（1.5 mL）中，逐管标记，离心（4000 r/min，8～10 min），立即检测或4℃冰箱中保存备用（要求尽快检测）。

1.2.2 PRV-gE蛋白ELISA抗体检测法

按照PRV-gE蛋白ELISA抗体检测试剂盒使用说明书操作。室温下，摇动浓缩洗涤液1～3 min，做20倍稀释。1∶1分别稀释待检血清和对照血清。各取稀释好的待检血清和对照血清100 μL于包被板微孔中，阴、阳对照各设两孔，放置于37℃恒温箱中孵育45 min，待抗原与抗体结合后，洗涤后，加入酶标记物100 μL，37℃孵育20 min，每孔各加50 μL底物A、B，室温避光显色15 min，每孔再加50 μL终止液，混匀。10 min内测各反应孔中的OD630nm值，稍后根据OD630nm值判定结果。

1.2.3 判定结果的标准

使用酶标仪测OD630nm值。试验成立的前提条件是阴性对照的OD630nm平均值与阳性对照的OD630nm平均值之差必须≥0.3。S表示各孔OD630nm值，N表示阴性对照各孔平均OD630nm值。若S/N值≤0.35，判断gE抗体阳性；若0.4≥S/N＞0.35，判断可疑；若S/N值＞0.4，判断gE抗体阴性。

1.2.4 统计分析

使用Excel软件统计分析试验数据，计算gE抗体阳性率、可疑率、阴性率。

2 试验结果

2.1 巴州地区猪场的PRV-gE蛋白抗体阳性率、可疑率、阴性率

猪场A、B在库尔勒市，C、D在轮台县，E、F在尉犁县，G、H在和硕县，I、J在若羌县，K、L在焉耆县，M、N在和静县，O、P在且末县，Q、R在博湖县。865份血清中检出gE抗体阳性82份，阳性率9.48%；检出可疑血清8份，可疑率为0.92%。猪场A—R中，只有A、D、G、I、N、Q场检测出可疑血清，可疑率分别为2.63%、4.76%、2.17%、2.13%、4.00%、1.72%，均小于10.0%。观察猪场A—R的gE抗体阳性率，不难发现其中最大值为17.78%，最小值是2.22%，结果见表1。

统计巴州地区9个不同区域的18个猪场的PRV-gE蛋白抗体检测平均阳性率发现：库尔勒市16.79%、轮台县9.13%、尉犁县8.81%、和硕县9.79%、若羌县7.32%、焉耆县11.22%、和静县10.28%、且末县3.44%、博湖县9.33%。结果发现，库尔勒市的PRV-gE蛋白抗体检测平均阳性率最高，为16.79%；焉耆县的仅次于库尔勒市，为11.22%；且末县最低，为3.44%，结果见表2。

2.2 各猪场不同年龄阶段猪群的PRV-gE蛋白抗体水平

对巴州地区的18个猪场进行PRV-gE蛋白抗体检测发现，PRV-gE蛋白抗体平均阳性率为9.48%。检测结果发现0～10日龄仔猪、11～20日龄仔猪、21～30日龄仔猪、后备母猪、经产母猪、种公猪PRV-gE蛋白抗体阳性率分别为18.95%、9.18%、14.29%、2.52%、9.09%和6.67%；分析不同年龄阶段猪群发现，后备母猪的PRV-gE蛋白抗体阳性率最低，为2.52%；阳性率最高的猪群是0～10日龄仔猪，为18.95%，结果见表3。

表1 巴州地区各猪场猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体ELISA检测结果

表2 巴州地区9个不同区域猪场PRV-gE蛋白抗体分析 （%）

3 讨论

3.1 巴州地区PRV-gE蛋白抗体阳性率偏低

使用PRV-gE蛋白ELISA抗体检测试剂盒对采自巴州地区的865份血清进行检测发现：有82份阳性血清，阳性率为9.48%，低于刘鸽[9]在2016年报道的北疆地区PRV-gE蛋白抗体阳性率（14.91%），低于张鲁安[10]在2005年报道的新疆PRV-gE蛋白抗体阳性率（10.1%），低于胡睿铭[11]等对2011—2013年采自9个省市的692份血清样品的PRV-gE蛋白抗体阳性率（67.05%），低于邹敏[12]等对2012—2013年来自18个省市的393个送检猪场共14 801份血清样品的PRV-gE蛋白抗体阳性率（16.13%）。其中18个猪场中，有3个猪场的PRV-gE蛋白抗体阳性率高于15%，分别为15.79%、17.78%、15.22%，最低为2.22%。通过检测结果发现，新疆巴州地区PRV-gE蛋白抗体阳性率偏低，但PRV在新疆巴州地区各猪场普遍存在。

表3 各猪场不同年龄阶段猪群的PRV-gE蛋白抗体水平检测

3.2 巴州地区的9个不同区域的PRV-gE蛋白抗体阳性率存在差异

统计巴州地区9个不同区域的18个猪场PRV-gE蛋白抗体检测平均阳性率发现：库尔勒市PRV-gE蛋白抗体检测平均阳性率最高，为16.79%；且末县最低，为3.44%。这说明不同区域的PRV-gE蛋白抗体阳性率存在差异，这与区域分布和各猪场的管理工作有一定关系，积极预防PR是猪场的重要工作。

3.3 不同年龄阶段猪群PRV-gE蛋白抗体阳性率存在差异

统计分析18个猪场不同年龄阶段猪群PRV-gE蛋白抗体阳性率发现：0～10日龄仔猪、11～20日龄仔猪、21～30日龄仔猪、后备母猪、经产母猪、种公猪PRV-gE蛋白抗体阳性率存在差异；其中0～10日龄仔猪PRV-gE蛋白抗体阳性率最高，后备母猪PRV-gE蛋白抗体阳性率最低。说明0～10日龄仔猪的感染率高，与母源抗体的分泌不足和血液传播有一定关系[13]。研究发现，仔猪体内10周和13周的gE抗体可能是母源抗体[14]。

3.4 加强管理，抓好净化猪场PR的工作

试验结果表明，PR在新疆巴州地区普遍存在，需要加强猪场的饲养管理和疾病预防工作[15]，做到严格消毒，定期对猪群进行PRV检测，检测频率通常为2次/年或者4次/年。及时发现并淘汰患PR的病猪，尤其是母猪和种公猪，因为PRV可在猪群中横向和垂直传播（通过公猪精液和母猪胎盘），因此，防止种猪感染PRV是防控和净化伪狂犬病的关键因素之一。在加强自身猪场免疫的同时，也要防止引种传播PRV，真正做到清内源和防外源。也可通过PRV-gE抗体定期监测，以便了解猪群免疫状态，查看疫苗保护效果。

3.5 使用疫苗对猪群进行科学免疫

目前，猪伪狂犬病的基因缺失苗对猪PR的免疫效果较好，可对初生仔猪进行滴鼻或者肌注免疫[16]。PR常发猪场可以进行全免，其他猪场可以进行部分免疫。免疫接种后，要及时进行PRV-gE蛋白的ELISA抗体检测，评估猪群野毒感染情况，及时淘汰患PR的病猪和免疫耐受的猪。近几年，PRV变异毒株出现，且处于独立进化分支，给PR的预防工作带来更大的困难[17-19]。并且，PRV与猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病2型（PCV2）等混合感染后，会影响免疫效果。

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