凡纳滨对虾P53亲水肽段原核表达及抗体制备

刘 欢， 黄明珠， 陈晓燕， 房春娟， 姜雯雯， 朱芳芳， 熊志伟

(江西科技学院护理学院，江西南昌 330098)

凡纳滨对虾(别称南美白对虾)是当今世界水产养殖业产量最高的三大虾类之一。随着养殖规模的扩大，对虾病害已经成为制约该产业发展的重要障碍。凡纳滨对虾为较低等的水生节肢动物，其生理特征表现为对病害的易感性。生长、发育的生命周期较短，各器官和系统形成迅速、构造简单，较高的新陈代谢水平和较低等的器官结构使得凡纳滨对虾对病原体抵抗能力较弱。凡纳滨对虾的鳃直接与水体接触，在进行呼吸和排泄时，各种外界恶劣的环境条件直接接触鳃结构，因此病原体较易感染或通过鳃部而影响全身。凡纳滨对虾的生命周期中有蜕壳的生理特点，蜕壳前凡纳滨对虾停止进食，蜕壳之后虾体又非常脆弱，在此期间虾体的防御能力减弱，对病原体和敌害的抵抗力极差，因而极易被病原体感染[1]。随着养殖水域受到严重污染，水质的富营养化，水体的酸碱化，重金属污染等都是目前非常严重的问题[2]，养殖强度的扩大和养殖环境恶化将给对虾病害的控制带来更大的挑战。

机体在对抗病害、重金属、环境等因素胁迫时，会导致负氧离子等活性氧(ROS)的产生[3-4]，高浓度的氧化自由基会导致细胞损伤甚至细胞死亡[5]。P53与DNA的完整性、细胞周期、呼吸暴发都有密切联系[6-7]。亚硝酸盐应激诱导对虾血细胞产生了过量的NO和ROS，造成氧化胁迫作用，诱导凋亡P53基因的表达[8]。在重金属和低pH值环境的应激下，凡纳滨对虾P53基因表达与LvMnSOD和LvGPx有着密切的联系[9]。十足目的P53对损伤的DNA进行修复以保证正常的精子发生，或引发凋亡以去除不正常的精细胞[10]。本研究通过分析凡纳滨对虾P53序列亲水性，利用原核表达获得亲水肽段，免疫大白兔获得多克隆抗体，探索出1条简单高效地获得P53多克隆抗体的途径，为P53的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和载体 大肠杆菌EscherichiacoliDH5α、E.coliBL21菌株，原核表达载体pet32a，PMD-18T载体，购自TaKaRa公司。

1.1.2 试剂 弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂，为Sigma公司产品；NC膜为Pall Life Science公司产品；Ni NTA填料，Trizol试剂，购自Invitrogen公司；酵母浸出膏、胰蛋白胨、蛋白胨，为MD Bioscience公司产品；DNA凝胶回收试剂盒、限制性内切酶、质粒小提试剂盒，为Axygen产品；反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit、T4DNA连接酶，为TaKaRa公司产品；预染低分子量蛋白Marker，为BIO-RAD公司产品；动物蛋白提取试剂盒，为生工生物工程(上海)股份有限公司产品；碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG，为北京鼎国生物科技有限公司产品。其余产品为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 从GenBank获得凡纳滨对虾P53基因序列(ANN87874.1)，通过在线网站(http：//tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input)预测P53亲水肽段，根据亲水肽段编码序列设计特异性引物，即上游引物P53s：5′-GCGAATTCATGCGTCACAAATTCGGCATCTCCCTC C-3′，下游引物P53x：5′-GCTCTAGATTAATGATGATGATG ATGATGGCAC TTGCAGCACTTAATGTCCAG-3′(包含酶切位点、终止密码子、6×His标签)扩增P53亲水肽段。引物由深圳华大基因合成。

1.2.2 凡纳滨对虾肝胰腺RNA提取和cDNA的合成 取肝胰腺，液氮冷冻研磨，按说明书Trizol法提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA。

1.2.3 扩增目的基因 以“1.2.2”节步骤中合成的cDNA为模板，利用设计的特异性引物进行PCR扩增，程序为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 4 min，4 ℃保存。PCR产物通过1%琼脂糖胶电泳检测，紫外灯下切胶后，用DNA凝胶回收试剂盒回收。

1.2.4 鉴定目的片段 将“1.2.3”节步骤回收的DNA片段与PMD-18T载体连接后，转化大肠杆菌DH5a，转化后涂氨苄青霉素(Amp)固体平板，37 ℃培养过夜，挑阳性克隆进行菌液PCR，测序。测序正确的载体命名为PMD-18T-P53。

1.2.5 表达载体构建 用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ对PMD-18T-P53和pet32a载体分别进行双酶切，酶切产物跑1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切胶，通过DNA凝胶回收试剂盒回收，回收产物按物质的量比1 ∶5混合，按比例加入T4 DNA连接酶，4 ℃过夜，转化DH5α，转化后涂平板，37 ℃过夜培养，挑阳性克隆进行菌液PCR检测，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序正确的载体命名为pet32a-P53。

1.2.6 融合蛋白诱导 将构建的重组表达质粒转化进BL21，转化后涂平板，37 ℃培养过夜，挑阳性克隆进行菌液PCR验证。验证正确的菌株接种于含100 mmol/L Amp的LB液体培养基中，180 r/min、37 ℃培养至D600 nm为0.4～0.6，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside，简称IPTG)，使之终浓度为1 mmol/L，诱导3 h后，每隔1 h取样，跑十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE)蛋白胶检测蛋白表达情况。

1.2.7 发酵产物纯化 大量发酵后，收集菌体，用磷酸缓冲液重悬，在超声波下破碎30 min；8 000 r/min，4 ℃，离心 15 min，弃上清；用含4 mol/L尿素的缓冲液溶解，12 000 r/min，4 ℃，离心20 min，留上清，0.4 μm滤膜过滤；依照Ni-NAT操作手册进行蛋白纯化，跑SDS-PAG蛋白胶检测蛋白纯化情况。

1.2.8 抗体制备 重组蛋白溶液(含0.5～1.0 mg重组蛋白)加等体积弗氏完全佐剂，用注射器混匀，分多点注射于大白兔腹部及腹股沟，每隔7 d免疫1次，免疫4次后，收集血清。

2 结果与分析

2.1 目的片段扩增

由图1、图2可知，通过在线网站预测P53亲水肽段，以编码亲水肽段cDNA为模板扩增目的片段，琼脂糖凝胶电泳验证表明，在500 bp左右有亮带，与预期大小相符，经测序证实确为P53序列。

2.2 表达载体构建

分别双酶切载体和目的基因后，连接酶切后所需片段，转化大肠杆菌BL21，扩大培养后，提取质粒，对质粒进行双酶切验证。由图3可知，电泳后有2条条带，较大的为开环pet32a，较小 500 bp 左右的片段为目的片段，证实表达载体构建成功。

2.3 融合蛋白诱导表达及纯化

将构建好的原核表达菌株经IPTG诱导后，经SDS-PAGE蛋白胶检测，以加入IPTG之前菌体为对照，由图4可知，诱导后的菌体在18 ku左右有明显差异条带，符合预期大小；由图5可知，通过镍(Ni)柱纯化后得到较单一条带。

2.4 抗体制备检测

纯化蛋白免疫新西兰白兔后，取血清，用抗体稀释液与肝胰腺总蛋白进行Western blot，结果见图6。

3 讨论

由于LvP53 ORF有超过1.5 kb的DNA序列，编码蛋白分子量过大，不易表达，所以选择其中一段含有多个亲水位点的(即含多个抗原表位)序列。原核表达方法成熟且表达量大，通过原核表达获得高拷贝数的免疫活性的P53抗原。在PCR获得目的片段和连接酶切位点时，一般方法必须经过2次PCR。在本研究中，直接连上酶切位点和HIS标签，引物设计超过20 bp，下游引物达到53 bp，1次PCR，一步到位，节约了时间和试剂。不足的是PCR产物中有大量的引物二聚体，通过切胶回收目的条带，也能满足做下一步研究的需求。

参考文献：

[1]沈文英，阳会军，尹军霞. 南美白对虾的病害及防治研究现状[J]. 水利渔业，2004，24(1)：58-60.

[2]宋盛宪，古群红. 南美白对虾无公害健康养殖技术[J]. 江西水产科技，2006(1)：36-38.

[3]Chanock S J，Benna J，Smith R M，et al. The respiratory burst oxidase[J]. Journal of Biological Chemistry，1994，269(40)：24519-24522.

[5]Valko M，Leibfritz D，Moncol J，et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2007，39(1)：44-84.

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[7]Pani G，Koch O R，Galeotti T. The p53-p66shc-manganese superoxide dismutase (MnSOD) network：a mitochondrial intrigue to generate reactive oxygen species[J]. International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2009，41(5)：1002-1005.

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[10]侯聪聪. 十足目甲壳动物顶体构架体及精子发生相关蛋白功能研究[D]. 杭州：浙江大学，2015.