MS-222麻醉剂对短须裂腹鱼人工繁殖的麻醉影响

邓龙君， 甘维熊， 刘小帅， 曾如奎， 刘明昌， 曾 焱， 朱 欧， 冯 钢

(雅砻江流域水电开发有限公司，四川成都 610051)

1 材料与方法

1.1 材料

试验用水：采用雅砻江支沟磨子沟水，符合国家二类水质标准。经循环水系统和温控系统处理，车间和催产池水温(14.5±1)℃，pH值为8.4，溶解氧(dissolved cxygen，简称DO)含量≥8 mg/L。

试验用鱼：短须裂腹鱼苗为锦屏·官地鱼类增殖站2014年自行繁殖的鱼苗，平均体长(17.9±1.7)cm，平均体质量(50.8±15.3)g，健壮无伤，试验前暂养于养殖缸(r=1 m)内，试验开始前24 h进行停食。雌亲鱼腹部膨大柔软，体长44.5～64.5 cm，体质量0.9～3.3 kg；雄亲鱼珠星明显，体长37.5～48.0 cm，体质量0.5～1.3 kg，产前暂养于25 m2的催产池内，进行流水刺激，产卵期间不投食。

试验药品及仪器：鱼用麻醉剂MS-222(间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐)，购自上海康汀生物科技公司(纯度≥98%)。HI 9829多参数水质测定仪，哈纳沃德仪器公司；FA2004电子天平(最大称量值=200 g，精确度=0.1 mg)，上海舜宇恒平科学仪器公司；Scout SE电子天平(最大称量值=600 g，精确度=0.01 g)，奥豪斯仪器公司。

1.2 试验设计

在人工繁殖中，亲鱼在催产和授精时需多次重复麻醉，麻醉后的亲鱼在授精时会离水并于空气中暴露一定时间，暴露时间依据卵子的排空时间而定。本研究选择MS-222并设置40、60、70、80、100 mg/L共5个浓度，首先以鱼苗为对象，测定有效麻醉浓度；其次在有效浓度中深度麻醉鱼苗并于空气中暴露2～12 min后复苏，确定适宜的暴露时间范围；同时在有效浓度中每隔4 h深度麻醉鱼苗1次，共4次，测试反复麻醉对复苏的影响。在此基础上，以待产亲鱼为对象，测定有效浓度、空气中暴露时间和重复麻醉对其人工繁殖和受精率的影响。

1.3 不同浓度MS-222溶液的pH值

不同浓度MS-222溶液测得的pH值见表1，可见pH值变化包含在淡水渔业水质标准的pH值6.5～8.5范围内，因而各组未添加NaHCO3进行pH值调节。

表1不同浓度MS-222溶液的pH值

1.4 麻醉和复苏判定标准

参考MS-222麻醉鳜鱼研究中的麻醉和复苏不同阶段鱼的行为特征[3]作为判断标准，并结合试验鱼的实际表现，将麻醉和复苏分别分为5个阶段和4个阶段(表2)。麻醉时间从鱼被放入麻醉液中开始到麻醉A3期为止。复苏时间从麻醉鱼进入清水中开始到复苏R3期为止，1 h内未苏醒判定为死亡。根据Marking等认定的理想麻醉浓度标准[8]，本试验有效麻醉浓度设定为3 min内麻醉，5 min内复苏，15 min后成活率是100%的浓度。

表2麻醉和复苏过程分期及鱼的行为特征

1.5 预试验

(1)MS-222对鱼苗的麻醉效果：依据设计浓度，准确称取MS-222分别放入6个圆形塑料盆内(r=23 cm)，每盆均装有10 L洁净的循环水，充分搅拌均匀并静止2 min。将75尾鱼苗随机分成5组，每组15尾，分别放入以上配好的MS-222溶液中浸浴15 min后立即移出放入相同体积的循环水中进行复苏。观察鱼的行为特征，记录麻醉和复苏时间，以≥8尾鱼苗达到某一阶段特征的时间为准，测定有效麻醉浓度，并统计成活率。

(2)暴露时间对深度麻醉鱼苗复苏的影响：将35尾鱼苗放入有效麻醉浓度中8 min深麻，然后移出并用湿毛巾包裹鱼体中后部，置于空气中暴露0(对照)、2、4、6、8、10、12 min，之后再放入相同体积的循环水中复苏，记录复苏时间，每分钟数用鱼5尾，并统计复苏率。

(3)反复麻醉对深度麻醉鱼苗复苏的影响：将5尾鱼苗放入有效麻醉浓度中8 min深麻，然后移出并用湿毛巾包裹鱼体中后部，置于空气中暴露6 min后放入相同体积的循环水中复苏，记录复苏时间。每间隔4 h重复麻醉1次，连续麻醉4次。

1.6 MS-222对亲鱼人工繁殖的影响

3月19日挑选一批短须裂腹鱼亲鱼，20日19：00用有效麻醉浓度的MS-222将其麻醉后一次性注射促黄体激素释放激素类似物A2型(LHRH-A2)(16 μg/kg)、马来酸地欧酮(DOM)(5 mg/kg)和绒毛膜促性腺激素(HCG)(1 400 IU/kg)，23日 08：30 挑选临产雌鱼8尾，配对雄鱼8尾，随机分为2组。麻醉组采取单对试验法，将1对雌雄亲鱼放入有效浓度中麻醉，观察鱼的行为特征，记录麻醉时间；将进入麻醉期的亲鱼移出并计时，用湿毛巾包裹并拭干，实施采卵授精，记录离水拭干和卵子排空时间；延长亲鱼在空气中暴露时间至4 min，然后立即放入清水中进行复苏，记录复苏时间。对照组亲鱼不麻醉，直接采卵授精。授精后将受精卵清洗3次并脱黏放入孵化框中孵化，统计受精率。

1.7 数据处理

所有数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，结果以“平均数±标准差”表示。采用Excel进行回归分析，结果以回归方程和相关系数表示。

2 结果与分析

2.1 MS-222对鱼苗的麻醉效果

由表3可知，随着浓度的增加，麻醉时间呈现递减，而复苏时间呈现增加的变化趋势，各组鱼苗在浸浴15 min后全部存活，24 h后无一死亡。40 mg/L浓度下，鱼苗一直处于深度镇静的A1期，在358.6 s后小部分鱼苗在缓慢游动，大部分鱼苗静止不动，少数个体身体微侧，使其平躺后挣扎能恢复，15 min后放入清水中迅速恢复。60 mg/L浓度下不能达到深度麻醉的A4期，70 mg/L浓度下不能达到延髓麻醉的A5期。80 mg/L浓度下麻醉时间(140.4 s)<3 min，复苏时间(181.3 s)<5 min，而100 mg/L浓度下的复苏时间(327.2 s)则>5 min，因此80 mg/LMS-222为鱼苗的有效麻醉浓度。

2.2 暴露时间对深度麻醉鱼苗复苏的影响

深度麻醉的鱼苗在暴露不同时间全部复苏成活，由图1可知，暴露初期，各组鱼苗均呈现A4期深度麻醉的典型特征，鱼体平躺静止，对外界刺激无反应。随着暴露时间的增加，呼吸逐渐恢复，在空气中暴露286 s后，暴露时间为6～12 min 的4个组均有1尾鱼头部或尾部上翘挣扎，随时间延长挣扎越强烈。复苏时间随着暴露时间的延长呈现先下降后增加的趋势。暴露0 min(对照)时，复苏时间为129.8 s，极显著高于其他各组(P<0.01)；暴露2 min时复苏时间为 67.8 s，显著高于暴露4～12 min的5个组(P<0.05)；暴露10 min时复苏时间最少， 为22.6 s， 暴露12 min时复苏时间(37.6 s)则开始上升；但暴露4～12 min的5个组的复苏时间差异并不显著(P>0.05)。

表3不同浓度MS-222对鱼苗的麻醉效果

注：“—”表示试验过程中未观察到相应的状态。

2.3 反复麻醉对深度麻醉鱼苗复苏的影响

反复深度麻醉鱼苗的复苏时间变化，由图2可知，经过4次重复麻醉后，鱼苗的复苏时间差异不显著(P>0.05)，平均复苏时间为30 s。

2.4 MS-222对亲鱼麻醉和暴露后复苏的影响

80 mg/L MS-222对亲鱼麻醉和暴露4 min后复苏的影响见表4，可见雌鱼进入麻醉A3期的平均时间为 181.3 s，显著高于雄鱼(157 s)(P<0.05)，极显著高于鱼苗(140 s)(P<0.01)，雄鱼也高于鱼苗，但差异不显著。暴露后复苏，雌鱼达到复苏R3期的平均时间为135.5 s，显著高于雄鱼(101.3 s)(P<0.05)，均极显著高于鱼苗(39.4 s)(P<0.01)。雌鱼的麻醉时间略高于3 min，可见MS-222 80 mg/L对鱼苗和亲鱼均能起到较好的麻醉效果，但随着个体大小的增加，尤其是对于3 kg以上的亲鱼，应适当增加麻醉剂量。

表4MS-222对亲鱼麻醉和暴露后复苏的影响

注：同列数据后不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.5 MS-222对亲鱼人工繁殖的影响

80 mg/L MS-222对亲鱼人工繁殖的影响见表5，麻醉组雌鱼离水至卵子排空的平均时间为49 s，卵子排空的平均时间为25 s，分别极显著低于对照组的83.3和50.5 s(P<0.01)；且挣扎多发生于离水拭干时，雌鱼平均挣扎1.8次，尾巴左右摆动2.3次，雄鱼挣扎0.6次，尾巴摆动0.4次，仅有1尾雌鱼在采卵时挣扎1次，尾巴摆动1次。而对照组雌鱼平均挣扎3.2次，尾巴摆动4.3次，1尾雌鱼离水时剧烈挣扎并掉落在海绵垫上，3尾雌鱼在采卵时挣扎；雄鱼挣扎1.4次，尾巴摆动2.9次，3尾雄鱼在采精时挣扎，可见麻醉后亲鱼的挣扎次数和强度均明显降低。在空气中暴露110和89 s后，雌雄亲鱼逐渐恢复苏醒并翘起头部挣扎， 随着时间推移挣扎越强烈，尾部也摆动挣扎，甚至有腾空跳起现象，鳃盖张合开度明显大于平时，类似于人的“深呼吸”。麻醉组的平均受精率为77%，相比对照组(74.6%)差异不明显。

表5MS-222对亲鱼人工繁殖的影响

注：“—”表示未麻醉对照组无相应的状态及数据。

3 讨论

3.1 MS-222对短须裂腹鱼的麻醉效果

影响MS-222麻醉效果的因素较多，但在相同条件下，浓度起着决定性作用。本试验中，用不同浓度MS-222麻醉鱼苗，麻醉时间与浓度呈负相关，复苏时间与浓度则呈正相关。研究认为深度镇静期是运输的适宜时期[9]，麻醉期是操作的最佳时期[10]。当MS-222浓度为40 mg/L时，鱼苗可深度镇静，但不能麻醉，故40 mg/L可作为短须裂腹鱼苗运输和亲鱼站内转运的参考浓度，但是否适宜长途运输需进一步研究；60～100 mg/L 浓度时均能麻醉，可进行短时间的试验和生产操作，但60 mg/L浓度时不能深度麻醉，故60 mg/L可作为短时间操作的安全浓度；100 mg/L浓度时麻醉时间小于 3 min，而复苏时间比5 min长了27 s，推测90 mg/L可能也为有效麻醉浓度，尚有待进一步研究证实。这与MS-222麻醉光唇裂腹鱼稚鱼[7]的30～40 mg/L轻度镇静，60～70 mg/L不能深度麻醉，75～80 mg/L能深度麻醉的结论相似。

一般来说，鱼的规格越大，所需麻醉剂的剂量越高。本试验中，80 mg/L浓度时鱼苗进入麻醉期的时间最短，雄亲鱼次之，雌亲鱼最长(181.3 s)且略长于3 min，故在亲鱼催产授精时可适当增加麻醉剂量，如3 kg以上的亲鱼可用90 mg/L。这与MS-222麻醉泥鳅[1]、施氏鲟[4]、大鲵[11]的研究得出的规格越大，进入麻醉期时间越长的结论相符。Oikawa等研究认为，仔鱼期皮肤呼吸占很大比重，造成其对麻醉剂的敏感性较强；随着生长，皮肤呼吸的相对重要性逐渐下降，而鳃呼吸逐渐占据主导地位[12]。这可能就是光唇裂腹鱼稚鱼的有效麻醉浓度(60 mg/L)低于本试验短须裂腹鱼苗的主要原因，其次可能还有种间差异的缘故。

3.2 暴露时间和反复麻醉对短须裂腹鱼的影响

反复麻醉试验结果显示，4次重复麻醉对短须裂腹鱼苗的复苏时间无显著影响，说明在人工繁殖中可以多次使用 MS-222 重复麻醉亲鱼，以减少在挑选转运、催产授精时造成的损伤。本试验中，亲鱼在注射催产激素和采卵授精时的2次麻醉也充分证明了这一点。随着鱼的年龄和规格的增加，鳃呼吸逐渐占据主导地位，所需麻醉剂量也随之增加，但经鳃吸收的麻醉剂却极易导致窒息，且复苏率偏低[13]，故在生产中不可随意增加用量和任意延长麻醉时间。

暴露试验结果显示，鱼苗在空气中暴露4～10 min时，复苏时间无显著差异。为此选择将进入麻醉期的亲鱼在空气中暴露4 min后立即复苏，雌鱼的复苏时间最长，雄鱼次之。研究表明，将麻醉后的鱼体转入清水中，MS-222由鳃、皮肤等逐渐排出体外，其完全排出的先后顺序为肌肉、肝脏、脑和血液[14]。规格越大的鱼，麻醉后富集的MS-222越多，推测亲鱼暴露于空气中后，原本通过水体的排出通道不能顺畅进行，体内神经系统的麻醉剂则随着血液循环向身体其他部分分散，由此形成“神经系统—肌肉—湿润的外部环境”之间的排出通道[15]，使得神经麻醉程度逐渐降低，鱼在一定程度上恢复苏醒，复苏时间也随之减少。

3.3 MS-222对短须裂腹鱼人工繁殖的影响

经麻醉后的短须裂腹鱼亲鱼在采卵授精时，其挣扎次数和强度明显弱于未麻醉的对照组，且主要集中于离开水体和拭干体表水分的10 s左右时间。分析原因为进入麻醉期的亲鱼并未完全丧失反应能力，呼吸减弱但尚未停止，所以当亲鱼离水后会发生潜意识地挣扎，但麻醉作用使得鱼体挣扎力不从心，促使亲鱼采卵时间大为缩短，人工繁殖得以流畅进行，故亲鱼在繁殖过程中被人为损伤的程度就会大大降低。暴露期间，雌雄亲鱼分别在110和89 s后开始头部翘起挣扎，表明亲鱼在一定程度上已经苏醒并亟需水分和氧气。因此为不影响亲鱼的健康，完成1组麻醉后亲鱼的采卵授精应控制在 89 s 内，并立即放入清水中进行复苏。

受精卵的采集是增殖放流过程中的关键环节，影响受精率的主要因素为精卵质量和授精方法，其次为环境因素。麻醉后的短须裂腹鱼亲鱼在授精时还需要考虑麻醉剂的影响。Billard研究认为，麻醉剂在授精稀释液中的浓度大于0.05%时才会影响精子的活力，麻醉剂对人工授精时产生不利影响的概率很低[16]。Wagner等研究认为，丁香油、MS-222和CO2麻醉虹鳟时不会影响运动精子的百分比例，但能影响精子持续运动的时间，随着麻醉剂浓度的增加，精子持续运动的时间随之缩短，但麻醉组受精卵的发育和孵化出苗的畸形率均与对照组无显著差异[17]。本试验采用干法人工授精，拭干亲鱼体表带有MS-222的多余水分，以降低MS-222对精子持续运动时间的影响，统计分析麻醉组的受精率与对照组并无明显差异。

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