普通黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂种一代遗传特征的微卫星分析

李景芬， 采克俊， 公翠萍， 王 曙， 周志金

(1.湖州师范学院，浙江湖州 313000； 2.浙江省湖州市水产技术推广站，浙江湖州 313000)

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

取出无水乙醇固定的鳍条于另一1.5 mL离心管中，挥干乙醇，用小剪刀尽量剪碎鳍条，加入裂解液和蛋白酶K混匀，于55 ℃摇床中消化至溶液澄清透明。再向裂解液中加入RNase于37 ℃水浴锅中保温1 h。然后按传统的酚、三氯甲烷、异戊醇法提取基因组DNA。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和完整性，用紫外分光光度计检测质量浓度，并稀释至50 ng/μL，存于-20 ℃冰箱中待用。

微卫星引物序列参照文献[7]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息见表1。PCR反应体系总体积25 μL：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，引物2 μL，50 ng/μL DNA 2 μL，rTaq0.2 μ L，ddH2O 17.3 μL。PCR扩增反应条件：94 ℃ 预变性4 min；94 ℃变性30 s，58～70 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃终止延伸 5 min。PCR扩增产物用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，硝酸银染色，数码相机拍照。

利用Popgen 1.32软件统计所有位点的等位基因数、观测杂合度、期望杂合度。利用Cervus 3.0软件分析多态信息含量。利用MEGA 4.0软件构建不同群体的非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，简称UPGMA)亲缘关系树。

表16个微卫星位点引物序列及退火温度

注：F为正向引物，R为反向引物。

2 结果与分析

2.1 普通黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼(普通黄颡鱼♀×瓦氏黄颡鱼群体遗传特征

参考文献[7]的9对微卫星引物中，有6对引物(表1)能在普通黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼中扩增出清晰条带，扩增条带为90～460 bp。其中，引物AG240表现为种间特异性扩增，即普通黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼的扩增条带间存在明显差异。杂交黄颡鱼均显示2个条带，表现为亲本普通黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼的杂交组合带(图1)。

普通黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼、杂交黄颡鱼的等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、多态信息含量见表2。6个座位中，每个位点的等位基因数为1～9个。普通黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼在6个座位中除了AG240位点表现为单态，其余5个位点均表现为多态。瓦氏黄颡鱼群体有效等位基因数为3.026 8个(表中未列)、观测杂合度为0.349 0、多态信息含量为0.508 0，均高于普通黄颡鱼群体[有效等位基因数为2.008 2个(表中未列)、观测杂合度为 0.109 4、多态信息含量为0.320 3]。

杂交黄颡鱼有效等位基因数(2.863 2个，表中未列)、观测杂合度(0.338 5)、多态信息含量(0.501 2)高于母本普通黄颡鱼，低于父本瓦氏黄颡鱼。

表2普通黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼、杂交黄颡鱼的遗传多样性参数

注：Na为等位基因数；Ho为观测杂合度；He为期望杂合度；PIC为多态信息含量。

根据Nei’s上计算所得群体间遗传相似性系数和遗传距离，由表3可以看出，杂交黄颡鱼与母本普通黄颡鱼遗传相似度最高，为0.673 1，遗传距离最小，为0.395 9；杂交黄颡鱼与父本瓦氏黄颡鱼遗传相似度居中，为0.542 1，遗传距离也居中，为0.612 4；父本瓦氏黄颡鱼与母本普通黄颡鱼遗传相似度最小，为0.249 2，遗传距离最大，为1.389 6。

表3普通黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交黄颡鱼

注：对角线以下为遗传距离，对角线以上为遗传相似性系数。

根据群体间的Nei’s遗传距离，采用MEGA 4软件构建普通黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交黄颡鱼群体间的亲缘关系UPGMA树(图2)，可见杂交黄颡鱼(zjh)和母本普通黄颡鱼(pth)先聚为一支，再与父本瓦氏黄颡鱼(wsh)聚合。

2.2 微卫星位点亲子代间遗传传递

采用PopGene32软件对普通黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交1代群体基因条带进行统计、分析。由表4可以看出，普通黄颡鱼群体的基因型为1～9种，瓦氏黄颡鱼群体的基因型为1～9种，杂交子1代的基因型为1～14种。从各个微卫星位点看，杂交子1代的基因型种类与父本瓦氏黄颡鱼相当或略丰富(除去CT154位点)，且普遍比母本普通黄颡鱼基因型种类丰富。

表4普通黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交1代中基因型频率分布

注：A、B、C、D、E、F、G、H、I代表等位基因。

3 讨论与结论

3.1 普通黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼群体遗传多样性

3.2 种质资源鉴定

种质资源鉴定对探明物种和遗传资源有很重要的意义，是一项非常基础性的工作。传统的形态学特征作为鉴别依据在有些情况下很困难[12]，如黄颡鱼属的不同种鱼在形态上很相似，很难区别，尤其是处于早期生活史阶段的鱼苗及幼鱼。用同工酶法容易受到自然环境的影响[13]，而利用DNA分子标记则很少受到自然环境的限制，具有较高多态性的RAPD方法增加了种内和种间鉴定的可行性[14-15]。赵文学等采用RAPD方法对4种黄颡鱼进行了鉴定，筛选出6个引物可以用来准确鉴别黄颡鱼属的4种鱼类[10]。本研究采用SSR方法对普通黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和它们的杂种1代进行了遗传多样性分析，筛选出1个引物(AG240)可以准确鉴别这3种鱼。

参考文献：

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