桃蚜乙酰胆碱酯酶基因克隆及我国多地区桃蚜S431F突变频率检测

刘晓岚， 田兆丰， 李永丹

(1.中国农业大学农学与生物技术学院，北京100193； 2.北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京 100097)

乙酰胆碱酯酶是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标，变构乙酰胆碱酯酶是昆虫对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂产生抗性的重要原因[1-8]。最早于希腊发现桃蚜的乙酰胆碱酯酶变构，随后在日本、美洲及欧洲部分地区也有类似报道[9-13]。

监测桃蚜抗药性主要从室内毒力测定、生物化学测定及分子水平检测等3个方面进行，分子水平检测是了解桃蚜田间种群抗药性的重要手段[14-15]。昆虫抗药性的形成是药剂长期对昆虫基因选择的过程，昆虫抗性基因的研究也是研究昆虫抗药性的重要部分[16-15]。大量使用有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂导致各地桃蚜对这2种药剂分别产生了不同程度的抗药性[18-21]，1994年Moores等克隆了野生型桃蚜乙酰胆碱酯酶基因，公布了敏感型乙酰胆碱酯酶基因[9-10]，比较敏感与抗性桃蚜种群ace1和ace2的cDNA编码区发现，二者乙酰胆碱酯酶基因在活性中心存在氨基酸变异(S431F)，并推测该突变与桃蚜对抗蚜威抗性相关[22]。本研究克隆与桃蚜抗药性有关的乙酰胆碱酯酶基因ace2全长并进行注册，丰富了基因GenBank。对2015、2016年采自我国多地区的桃蚜田间种群进行乙酰胆碱酯酶基因的突变(S431F)检测及突变频率的统计，为了解我国各地桃蚜乙酰胆碱酯酶基因变异及抗药性情况提供依据。

1 试验材料

1.1 供试昆虫采集与饲养

于2014年在河北省定州市大岳镇的温室菜田采集用于乙酰胆碱酯酶基因cDNA克隆的桃蚜敏感种群，在中国农业大学昆虫生理毒理实验室针对抗蚜威反选育30代以上，致死中浓度(lethal concentration 50，简称LC50)为98.17 mg/L。

乙酰胆碱酯酶基因突变频率检测供试桃蚜种群分别于2015年和2016年的5—11月采自我国河北、辽宁、江苏、青海等多个地区的田间或温室，在中国农业大学昆虫生理毒理实验室采用蛭石培育的萝卜苗饲养，温度为23～25 ℃，相对湿度为60%，光—暗周期为16 h―8 h，均一化饲养1代以上用于生物测定。

1.2 试验试剂

LaTaq聚合酶、反转录试剂盒、DNA回收试剂盒、dNTP Mixture、rTaq聚合酶、DNA Marker DL2000、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside，简称IPTG)、载体pGEM-T easy连接试剂盒等，购自日本TaKaRa公司、美国Promega公司；Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司；DNA快速回收试剂盒、DH5α感受态细胞均购自博迈德生物技术公司。

1.3 主要试验仪器

5417C/R型台式高速冷冻离心机、PCR仪均购自德国Eppendorf公司；mini-sub cell GT型电泳槽、power/PAC 3000型电泳仪均购自美国Bio-Rad公司；紫外成像仪购自Kodar公司。

2 试验方法

2.1 乙酰胆碱酯酶基因(ace1、ace2)克隆

2.1.1 引物设计 根据桃蚜乙酰胆碱酯酶基因(ace1)序列(GenBank：AF287291.1)、桃蚜乙酰胆碱酯酶基因(ace2)不完全序列(GenBank：AY147797.1缺失3′端182 bp)，Primer 5软件设计引物以扩增我国桃蚜ace1全长和ace2已知片段；采用cDNA末端快速克隆技术(rapid-amplification of cDNA ends，简称RACE)扩增得到ace2基因3′端，经拼接得到ace2基因全长序列，引物序列见表1，引物均由Invitrogen公司合成。

表1乙酰胆碱酯酶基因(ace1、ace2)cDNA编码区克隆引物

2.1.2 总RNA的提取 总RNA的提取按Trizol提取试剂盒说明书操作。取约0.3 mL无翅成蚜，加入约1 mL Trizol，充分匀浆；加三氯甲烷振荡、静置后离心；上清液加异丙醇脱水离心，总RNA沉淀；RNA沉淀以75%乙醇清洗2次，干燥后加20 μL无酶水，溶解；置于-80 ℃条件下保存；用微量分光光度计测定所提取总RNA的浓度。

2.1.3 反转录 反转录采用TaKaRa生物公司反转录试剂盒，操作步骤参照说明书。无酶PCR管加总RNA(<1 μg/μL)、Oligo(dT)12～18、RNase free H2O，在70 ℃条件下保温10 min，迅速冰浴。加5×M-MLV buffer、 dNTP Mixture、RNase Inhibitor、RNase M-MLV、RNase free H2O在 42 ℃ 条件下保温1 h，70 ℃条件下终止反应，冰上冷却，-20 ℃ 条件下保存备用。用微量分光光度计测定cDNA浓度。

2.1.4 PCR扩增 PCR管加入10×PCR buffer、dNTP Mixture、Sense primer、Anti-sense primer、cDNA、LaTaqDNA polymerase、ddH2O。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性 30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃继续延伸10 min。1%的琼脂糖凝胶电泳紫外凝胶成像仪检测扩增产物。

2.1.4 DNA回收、连接及转化 回收DNA条带，加入胶液溶解；吸附柱回收。1%的琼脂糖凝胶电泳检测回收效率，回收产物置于-20 ℃条件下备用。PCR纯化产物与PGEM-T easy载体连接。转化DH5α感受态细胞。LB(lysogeny broth；含氨苄青霉素、40 μL的X-gal和4 μL的IPTG)培养基平皿涂布菌液，倒置37 ℃条件下培养；蓝白斑筛选，挑白斑单菌落到液体LB培养基(含氨苄青霉素)，振荡培养18 h。PCR检测目的cDNA。

2.1.5ace2基因3′末端快速扩增 采用Clontech公司RACE反转录试剂盒，按说明书的步骤进行操作。

PCR管I中生成的反应体系：2 μL 5×First-Stand buffer、1 μL DTT(Dithiothreitol)、1 μL dNTP Mix、0.25 μL RNase抑制剂、1 μL反转录酶、共5.25 μL，备用。PCR管Ⅱ中生成如下反应体系：1 μL总RNA模板、1 μL 3′-RACE CDS Primer A、2.75 μL RNase free H2O、共4.75 μL，置于 72 ℃，3 min；42 ℃，2 min。将PCR管Ⅰ反应体系加入PCR管Ⅱ中，总体系10 μL置于42℃，90 min；70 ℃，10 min。产物为3′-RACE-Ready cDNA。

Outer-PCR扩增体系：2.5 μL 10×Advantage 2 PCR buffer、1 μL dNTP Mixture (10 mmol/L each)、1 μL 3′RACE UPM (Universal Primer A Mix)、1 μL 3′RACE Anti-ense primer(ace2)、1 μL 3′-RACE-Ready cDNA、0.5 μL 50×Advantage 2 Plymerase Mix、18 μL PCR-Grade Water，共 25 μL，PCR(94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环； 72 ℃继续延伸10 min)扩增。

1%的琼脂糖凝胶电泳检测。若无目的扩增产物可以Outer-PCR扩增产物为模板，引物3′RACE NUP、3′RACE Nested primer(ace2)进行Inner-PCR反应PCR。产物回收、连接、转化及菌液检测同“2.1.4”节。

2.2 乙酰胆碱酯酶基因突变频率检测

采用DNAVzol试剂盒提取单头无翅成蚜DNA。将2015、 2016年采自我国河北、辽宁、江苏、青海等多个地区的桃蚜田间种群，各提取30个有效DNA。

选取健康单头无翅成蚜加入20 μL DNAVzol，充分研磨；离心，取上清液，加无水乙醇脱水沉淀，75%乙醇漂洗2次，DNA干燥后加适量双蒸水溶解，琼脂糖电泳检测浓度。

根据桃蚜乙酰胆碱酯酶基因(ace2)序列(GenBank：AY147797.1)，Primer 5引物设计软件设计突变位点S431F附近上下游引物(sense Primer TTTCTGGGTCATTTGGGCTG；Anti-sense Primer AGGCGAATAGTTCAACAATG)见图1，引物由Invitrogen公司合成。

以提取的各田间种群DNA为模板分别进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增条带(图2)。将清晰的单一条带样品送于Invitrogen公司进行测序。

2.3 数据分析

数据分析及作图采用SigmaPlot 10.0软件。

3 结果与分析

3.1 序列分析

克隆得到的ace1序列与NCBI中序列(GenBank：AF287291.1)进行比对后可完全匹配，ace1开放阅读框架(open reading frame，简称ORF)全长为1 995 bp，编码665个氨基酸。

采用cDNA末端快速克隆技术(RACE)根据NCBI中ace2片段序列(GenBank：AY147797.1ace2基因序列缺失3′端182 bp)得ace2基因3′端(图3)，拼接后得到ace2基因ORF全长序列，ORF全长为2 022 bp，编码674个氨基酸，ace2全长序列已提交NCBI(GeneBank：KJ561353)。

设计ace2全长引物，扩增桃蚜敏感品系ace2基因(图2)。

敏感种群乙酰胆碱酯酶基因(ace2)序列与NCBI中序列(GenBank：AY147797.1)对比发现，4个核苷酸序列发生突变，其中2个为无义突变(GCA-GCG、GTG-GTA)，另外2个为有义突变(TTA-TCA、TCA-TTT)，氨基酸55位的亮氨酸变为丝氨酸(L55S)及431位的丝氨酸变为苯丙氨酸(S431F)(图4)，其中S431F已报道与桃蚜不敏感AChE抗性有关[22]。

3.2 2015、2016年桃蚜田间种群乙酰胆碱酯酶基因突变频率

2015年我国桃蚜S431F突变均已达到较高水平，在检测的15个种群中，有10个种群被检测个体达到100%突变，另外5个种群突变频率也在90%左右(图5)。其中，河北宽城种群突变频率最低，为86.67%，其次为辽宁大连种群，突变频率为90.00%，这与各种群抗蚜威抗性生物测定及乙酰胆碱酯酶对抗蚜威敏感度测定结果(待发表)相一致，其他各地种群间突变频率不存在显著差异。

在2016年检测的16个种群中，有11个种群S431F突变频率达到100%，另外5个种群突变频率也在90%左右(图6)。其中，河北康保、上海金山和四川井研种群突变频率较低，依次为86.67%、86.67%、93.55%，与生物测定、敏感度测定结果(待发表)基本一致。其他各种群间突变频率也不存在明显差异，说明与对抗蚜威生物测定及乙酰胆碱酯酶敏感度测定结果相关性较低。

3.3 乙酰胆碱酯酶突变频率与抗药性关系的验证

为验证乙酰胆碱酯酶基因突变与抗蚜威抗性的关系，以抗蚜威LC10、LC50、LC80处理筛选的敏感品系桃蚜种群，ace2基因S431F突变个体数及总检测数见图7，随着处理药剂浓度的升高，发生突变的个体频率也随之升高(图8)。

4 讨论

乙酰胆碱酯酶(AChE)基因包括ace1、ace2，在AChE活性中心影响AChE催化活性及对有机磷和氨基甲酸酯类药剂抗性发展中，ace2比ace1作用更显著[22]。本试验克隆的敏感品系桃蚜(笔者所在实验室筛选)AChE基因ace1、ace2经比对，ace1序列与NCBI中序列(GenBank：AF287291.1)可完全匹配。ace2序列与NCBI中序列(GenBank：AY147797.1)对比发现有2个氨基酸有义突变(L55S、S431F)，可见筛选的敏感品系桃蚜(LC50为98.17 mg/L)也存在AChE基因突变，这与2015年河北宽城种群(LC50为76.37 mg/L)对抗蚜威抗性比敏感种群低这一生测结果(待发表) 一致。同时进一步确定ace2与对有机磷和氨基甲酸酯类药剂抗性相关。

2015、2016年分别检测出15、16个桃蚜田间种群乙酰胆碱酯酶基因突变(S431F)频率，分别有超过66%和超过68%的种群被检个体100%发生突变，说明我国大部分地区桃蚜基因突变频率已达到较高水平，这与2015、2016年种群对抗蚜威产生高水抗性结果一致。但乙酰胆碱酯酶对抗蚜威抗性除S431F突变外，可能还有其他原因如检测到的ace2 L55S突变等，还有待于进一步研究。

抗蚜威敏感品系3个不同生测剂量(LC10、LC50、LC80)处理桃蚜混合种群，随着处理剂量的增高，存活桃蚜个体乙酰胆碱酯酶基因S431F突变频率也随之增高，结果进一步验证了对抗蚜威产生抗性与乙酰胆碱酯酶基因S431F突变相关。

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