有机物料接种蚯蚓对设施菠菜产量及品质的影响

吴 迪， 刘满强， 焦加国， 薛利红， 杨林章

(1.江苏省农业科学院农业资源与环境研究所，江苏 南京 210014； 2.南京农业大学资源与环境科学学院土壤生态实验室，江苏 南京 210095)

高度集约化耕作方式在环境污染和食品安全方面的弊端日益突出。通过增施有机肥改善土壤环境,提高作物品质及减少化肥投入实现未来环境友好农业可持续发展已成为共识[1]。中国农业废弃物资源极为丰富，有机废弃物既是重要的有机肥源，又是环境污染源，充分利用有机废弃物资源是变废为宝并促进农业生产的有效措施[2]。利用农业固体废弃物制成的有机肥可作为作物生长很好的氮源，促进作物生长[3]。然而，有机废弃物制成的有机肥存在养分含量低、当年利用率低、重金属含量高、施用数量大等问题，严重制约了其实际应用价值，尤其是不能及时满足生长期较短、需肥较多的蔬菜生长的需求[4]，而农田生态系统中最重要的“工程师”蚯蚓可以弥补这个缺陷。

蚯蚓可以通过分解土壤表面的有机物料，增加植物对养分的吸收从而促进作物生长[5],也可以通过刺激微生物活性产生植物调节物质，促进作物根系生长发育，进而提高作物的产量和品质[6]。目前国内外大量研究蚯蚓堆肥后的产物蚯蚓粪对土壤、作物产量和品质的影响[7-10]，较少研究者关注蚯蚓对作物产量和品质影响的直接作用[11]。由于制取蚯蚓粪需要特定的装置，为了降低在运输和装置处理上的成本，本研究直接利用农田作为蚯蚓的一个大生态床，拟建立“有机物料+蚯蚓”的生产模式，探究这种生态农业生产方式对作物产量和品质的影响机制。在田间试验的过程中，蚯蚓的活性受到很多因素的影响，要确保蚯蚓接种成功并生长良好，不仅要为其提供丰富的食源，且应尽量选择适合蚯蚓生存的环境友好型有机物料[12]。另一方面，蚯蚓生态型(品种)的选择也至关重要，不同种蚯蚓对生境要求不同，蚯蚓粪性质也存在差异，从而对作物的产量和品质产生不同的影响[13]。

本研究以菠菜(SpinaciaoleraceaLinn)为试验材料，利用设施菜地，通过2个田间试验拟研究有机物料(腐熟牛粪)施用方式和不同种蚯蚓对设施菠菜产量、营养品质和安全品质(重金属含量)的影响，并进一步探究蚯蚓对设施菠菜产量、营养品质和安全品质的影响与施用有机物料种类的关系，为农田生产应用及管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

1.2 供试材料

试验选用的蚯蚓品种为赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)和威廉腔环毛蚓(Metaphireguillelmi)。试验选用种植的菠菜品种为内蒙古圆叶大菠菜(SpinaciaoleraceaLinn)。供试有机物料：(1)腐熟的牛粪，选自苏州市相城区望亭镇新埂村奶牛场。施用腐熟牛粪(以下所有的“腐熟牛粪”简称为“牛粪”)的基本性质为含水量80%，全氮21.05 g/kg，全磷11.30 g/kg，全钾3.25 g/kg，全铜46.820 mg/kg,全镉0.522 mg/kg, 全铅2.390 mg/kg , 全锌200.550 mg/kg；(2)商品有机肥，选自沃丰有限公司生产的商品有机肥，其基本性质为含水量18%，全氮11.90 g/kg，全磷9.56 g/kg，全钾9.50 g/kg，全铜53.080 mg/kg,全镉0.646 mg/kg, 全铅3.350 mg/kg, 全锌215.480 mg/kg；(3)食用菌渣，选自苏州市相城区望亭镇新埂村食用菌厂生产蘑菇的下脚料，其主要成分为棉籽壳、麸皮和石灰。其基本性质为含水量75%，全氮6.70 g/kg，全磷2.03 g/kg，全钾2.31 g/kg，全铜12.500 mg/kg,全镉0.193 mg/kg, 全铅2.510 mg/kg, 全锌45.860 mg/kg。

1.3 试验设计

试验Ⅰ：田间试验小区建于2010年9月，试验小区由硅酸钙板围成，大小为 2.4 m×1.2 m，埋入地下0.6 m深，高出地表0.2 m，以防止蚯蚓逃逸。小区与小区间隔0.5 m。本试验共设计6个处理，每个处理3个重复。6个处理分别是：牛粪表施(S)、牛粪表施+赤子爱胜蚓(SE)、牛粪表施+威廉腔环毛蚓(SM)、牛粪混施(I)、牛粪混施+赤子爱胜蚓(IE)、牛粪混施+威廉腔环毛蚓(IM)。牛粪施用量为30 t/hm2，混施是指将牛粪施用到土壤中，与耕作层(20 cm)土壤混匀，表施是指土壤耕作后，将牛粪均匀地散在土壤表面。其中，牛粪作为基肥一次性施用，在整个菠菜生产期内不添加任何化肥或追施肥料。2种蚯蚓经清肠处理后，接种量按60 g/m2[相当于 (100±5)条赤子爱胜蚓，(30±2)条威廉腔环毛蚓]进行接种[14]。尽量将蚯蚓按一定的间距均匀散放到田面，接种后观察蚯蚓的入土情况，需要时更换掉活性差的蚯蚓。菠菜收获后对所有小区进行 0.3 m×0.3 m×0.3 m样方取样，调查蚯蚓的存活率及生物量。

试验Ⅱ：田间试验小区建于2011年9月，试验小区由硅酸钙板围成，大小为 2.4 m×1.2 m，埋入地下0.6 m深，高出地表0.2 m，以防止蚯蚓逃逸。小区与小区间隔0.5 m。本试验共设计6个处理，每个处理3个重复。6个处理分别是：商品有机肥(O)、商品有机肥+赤子爱胜蚓(OE)、腐熟牛粪(C)、腐熟牛粪+赤子爱胜蚓(CE)、腐熟牛粪+菌渣(1∶1)(CM)和腐熟牛粪+菌渣(1∶1)+赤子爱胜蚓(CME)。其中，商品有机肥为沃丰有机肥(施用量18 t/hm2)，牛粪施用量为30 t/hm2，牛粪与食用菌渣等质量(1∶1)施用，各不同有机物料作为基肥一次性施用，与耕作层(20 cm)土壤混匀，在整个作物生产期内无任何肥料添加。赤子爱胜蚓经过清肠处理后，接种量按60 g/m2[相当于 (100±5)条赤子爱胜蚓]接种[14]。尽量将蚯蚓按一定的间距均匀散放到田面，接种后观察蚯蚓的入土情况，需要时更换掉活性差的蚯蚓。菠菜收获后对所有小区进行 0.3 m×0.3 m×0.3 m样方取样，调查蚯蚓的存活率及生物量。

1.4 样品采集与分析

1.4.1 植株样品的采集 菠菜生长季为每年10月初到12月初。在菠菜成熟期，所有试验小区先采收 0.5 m×0.5 m样方面积的菠菜，抖掉根系上的土，放入塑料袋，带回实验室称质量后用于菠菜品质的测定。接着采收每个小区剩下区域的菠菜，称质量后加上样方菠菜质量一起作为菠菜的产量。采收样方里的菠菜用蒸馏水洗干净后，选出一半鲜样植株测定菠菜的营养指标，另一半植株用信封装好，放入烘箱中，105 ℃杀青30 min， 70～80 ℃烘至恒质量后，测定菠菜安全品质指标重金属含量。

1.4.2 植株样品的分析

1.4.2.1 菠菜营养品质指标的测定 在菠菜的鲜样植株中，采用2,6-二氯酚靛酚法[15]测定菠菜叶片中维生素C含量，采用蒽酮比色法[16]测定菠菜叶片中可溶性糖含量，采用考马斯亮蓝G-250染色法[17]测定菠菜叶片中可溶性蛋白含量，采用水杨酸比色法[15]测定菠菜叶片中硝酸盐含量。

1.4.2.2 菠菜安全品质指标的测定 采用HNO3/H2O2湿法消解，烘干的菠菜样品粉碎过20目筛，称0.500 g样品于三角瓶中，加10 ml HNO3过夜，于电热板上缓慢加热至剩余 1～2 ml，取下冷却后加入2 ml H2O2，于电热板蒸干至溶液呈清澈透明状态，冷却，定容，过滤后上ICP仪测定Cu、Cd、Pb和Zn含量。

1.5 数据分析

采用SPSS软件对数据进行统计分析，分析前用Kolomogorov-Smirnov和Levene方法检验数据的正态分布及方差齐性，并在必要时对数据进行对数转换。在试验Ⅰ中，采用双因素方差分析有机物料施用方式及不同蚯蚓品种之间的交互作用。采用单因素方差分析不同种蚯蚓对菠菜产量及品种的作用。在试验Ⅱ中，以独立样本T检验分析有无蚯蚓的差异，均值比较检验采用Duncan氏法。采用Origin8.5软件制图。

2 结果与分析

2.1 蚯蚓生物量

在试验Ⅰ和Ⅱ菠菜收获后，本研究对所有试验小区进行蚯蚓生物量的田间调查。所有接种蚯蚓的小区，蚯蚓的生物量基本上都保持70%以上，而未接种蚯蚓处理的小区未发现蚯蚓。这些基础条件为试验的成功进行提供了保障。

2.2 菠菜产量

无论牛粪表施还是混施，2种蚯蚓均显著地提高了菠菜的产量(图1)。赤子爱胜蚓和威廉腔环毛蚓分别提高菠菜产量 32.78%～37.23%和 18.70%～44.26%(图1)。另外，在施用不同有机物料条件下接种赤子爱胜蚓能显著地提高菠菜产量(图2)。其中，施用牛粪+食用菌渣中接种赤子爱胜蚓菠菜产量最高，而施用商品有机肥接种赤子爱胜蚓菠菜产量增幅最小(图2)。

图中不同小写字母表示在有机物料表施或混施处理中，接种不同蚯蚓品种间差异显著(P<0.05)。S：表示牛粪表施，I：表示牛粪混施。图1 蚯蚓和有机物料施用方式对菠菜产量的影响Fig.1 Effect of earthworms and manure placement on the spinach yield

2.3 菠菜的营养品质

无论牛粪表施还是混施，赤子爱胜蚓均显著提高了菠菜的可溶性糖和维生素C含量(图3A, 图3 B)，但未对菠菜可溶性蛋白和硝酸盐含量产生影响(图3C, 图3D)。而威廉腔环毛蚓对菠菜营养品质指标的影响并不显著(图3)。在不同有机物料比较试验中，本研究发现，除了施用商品有机肥处理外，在施牛粪或牛粪+食用菌渣条件下，接种赤子爱胜蚓均显著提高菠菜叶片中可溶性糖和维生素C含量，但对菠菜可溶性蛋白和硝酸盐含量无显著影响(图4)。

图中不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。O：表示施用商品有机肥，C：表示施用牛粪，CM：表示施用牛粪+食用菌渣。图2 不同有机物料接种蚯蚓对菠菜产量的影响Fig.2 Effect of earthworms on the spinach yield under different manure application

A：菠菜可溶性糖含量；B：维生素C含量；C：可溶性蛋白含量；D：硝酸盐含量。S：表示牛粪表施，I：表示牛粪混施。图中不同小写字母表示在有机肥表施或混施处理中，接种不同蚯蚓品种间差异显著(P<0.05)。图3 蚯蚓和有机物料施用方式对菠菜营养品质的影响Fig.3 Effect of earthworms and manure placement on the spinach nutritional quality

A：菠菜可溶性糖含量；B：维生素C含量；C：可溶性蛋白含量；D：硝酸盐含量。O：表示施用商品有机肥，C：表示施用牛粪，CM：表示施用牛粪+食用菌渣。图中不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。图4 不同有机物料接种蚯蚓对菠菜营养品质的影响Fig.4 Effect of earthworms on the spinach nutritional quality under different manure application

2.4 菠菜的安全品质

从表1可以看出，蚯蚓和施肥方式对菠菜中重金属的含量并没有交互作用。无论牛粪表施还是混施，接种赤子爱胜蚓都显著降低菠菜中Cu、Pb和Zn的含量。在不同有机物料比较试验中，除了施用商品有机肥外，在施用牛粪或牛粪+食用菌渣处理中接种赤子爱胜蚓显著降低菠菜中Cu、Pb和Zn的含量(表2)。

表1蚯蚓和施肥方式对菠菜中重金属含量的影响

Table1Effectofearthwormsandmanureplacementonheavymetalcontentofspinach

处理 菠菜重金属含量(mg/kg)CuCdPbZnS8．272±0．527a0．047±0．005a0．187±0．011a17．532±1．134aSE5．688±1．096b0．045±0．005a0．147±0．022b15．401±1．035bSM6．868±1．277ab0．042±0．004a0．170±0．009ab16．184±1．274abI8．300±1．003a0．048±0．003a0．180±0．013a17．872±0．906aIE6．367±0．675a0．043±0．004a0．150±0．005b15．157±0．889bIM7．406±0．422ab0．041±0．006a0．163±0．007ab16．237±0．978ab

S表示牛粪表施未接种蚯蚓；SE表示牛粪表施并接种赤子爱胜蚓；SM表示牛粪表施并接种威廉腔环毛蚓；I表示牛粪混施未接种蚯蚓；IE表示牛粪混施并接种赤子爱胜蚓；IM表示牛粪混施并接种威廉腔环毛蚓。同列数据后不同小写字母表示在处理间差异显著(P<0.05)。

3 讨 论

依据蚯蚓的生活习性及其在生态系统中的功能，一般将蚯蚓分为3种生态类型[18]：(1) 表层种：也称表居型，是指居住和取食都在土壤表层，以有机质和腐烂中的植物残体为食。(2) 内层种：也称土居型，是指居住和取食均在土壤内，以混入土壤中的土壤有机质为食的蚯蚓类群，其繁殖力和种群数量较低。(3) 深层种：也称上食下居型，一般生活在深入土体的永久或半永久穴道里，主要取食土壤腐殖质和微生物的蚯蚓类群。本研究中赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)属于表层种，主要取食有机物,当地的土著种威廉腔环毛蚓(Metaphireguillelmi)属于内层种，主要取食富含有机物的土壤。相比之下，施加牛粪等有机物料更适合赤子爱胜蚓的生境。

表2不同有机物料接种蚯蚓对菠菜中重金属含量的影响

Table2Effectofearthwormsonheavymetalcontentofspinachunderdifferentmanure

处理 菠菜重金属含量(mg/kg)CuCdPbZnO7．831±0．193a0．046±0．002a0．187±0．002a16．677±0．345aOE7．368±0．339a0．048±0．004a0．185±0．003a16．284±0．474aC7．819±0．115a0．047±0．006a0．173±0．009a17．870±0．606aCE6．388±0．260b0．048±0．008a0．134±0．012b15．627±0．353bCM8．180±0．234a0．047±0．008a0．180±0．012a17．290±1．032aCME6．472±0．365b0．043±0．005a0．142±0．010b14．242±1．016b

O表示商品有机肥混施；OE表示商品有机肥混施接种赤子爱胜蚓；C：表示牛粪混施；CE：表示牛粪混施接种赤子爱胜蚓；CM：表示牛粪+食用菌渣混施；CME：表示牛粪+食用菌渣混施接种赤子爱胜蚓。同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

3.1 有机物料接种蚯蚓对菠菜产量的影响

3.2 有机物料接种蚯蚓对菠菜品质的影响

以往的研究主要围绕蚯蚓对作物产量的作用展开，而忽略了蚯蚓对作物品质的影响[21]。作物的品质可分为营养品质和安全品质两方面。利用蚯蚓处理有机废弃物得到的产物—蚯蚓粪可以提高作物的营养品质。胡佩等[22]通过试验发现，蚯蚓粪中富含各种益生菌及代谢产物，这些微生物不仅使复杂物质矿化为植物易于吸收的有效物质，而且还可以合成一系列具有生物活性的物质，如糖、氨基酸、维生素等，在蔬菜营养品质的次级代谢产物形成的过程中发挥着重要重要。Wang等[7]通过将蚯蚓粪与土壤按不同比例混合种植上海青，发现蚯蚓粪与土壤比例4∶7时，显著提高了青菜叶片中维生素C的含量，当比例为 2∶7，4∶7以及7∶0时均显著提高了上海青叶片中可溶性糖含量。同时，Song等[10]通过施用蚯蚓粪，显著地提高了菠菜维生素C含量。本研究将农田土壤当做一大生态床，采用“有机物料+蚯蚓”的农业生产方式，发现接种赤子爱胜蚓后菠菜的可溶性糖和维生素C含量同样显著提高。一方面可能来自蚯蚓在田间取食有机物料形成蚯蚓粪所产生的作用；另一方面，蚯蚓分泌的黏液中含有16种氨基酸，为蔬菜营养品质提供了合成或代谢的物质基础[23]。另外，由于中国对有机物料还田的使用还缺乏有毒有害物质的限量要求，因此，正确评价有机物料对农产品质量(尤其是重金属含量)的影响备受关注。本研究发现接种赤子爱胜蚓后，菠菜中重金属Cu、Pb和Zn的含量显著降低。可能存在以下2方面原因：一方面蚯蚓对重金属有生物富集作用，Sharma等[24]曾报道蚯蚓通过取食作用导致组织体内Pb、 Cu、Mn、Ca、 Fe和Zn含量显著增加；另一方面，Song等[25]研究发现蚯蚓活动能促进腐殖酸组分形成，腐殖酸能够对重金属产生很强的吸附能力，形成稳定的金属-腐殖酸络合物，导致可被植物吸收的有效态重金属含量降低。通过施用不同有机物料条件下接种赤子爱胜蚓的试验，发现对菠菜产量和品质综合效果最好的是施用有机物料牛粪+食用菌渣。这可能是由于商品有机肥是经过加工成颗粒状，并不匹配赤子爱胜蚓的偏好而食用菌渣比较疏松并含有大量的有益微生物。

参考文献：

[1] ELSER J J, BRACKENM E, CLELAND E E, et al. Global analysis of nitrogen and phosphorus limitation of primary producers in freshwater, marine and terrestrial ecosystems[J]. Ecology Letters, 2007, 10(12): 1135-1142.

[2] JU X T, XING G X, CHEN X P, et al. Reducing environmental risk by improving N management in intensive Chinese agricultural systems[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106(9): 3041-3046.

[3] GATTINGER A, MULLER A, HAENI M, et al. Enhanced top soil carbon stocks under organic farming[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109(44): 18226-18231.

[4] 薛延丰,李泓坤,石志琦. 复混肥和干预剂对青菜品质及土壤理化性状的影响[J]. 南方农业学报, 2011, 42(7): 760-764.

[5] EISENHAUER N, SCHEU S. Earthworms as drivers of the competition between grasses and legumes[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2008, 40(10): 2650-2659.

[6] BERTRAND M, BAROT S, BLOUIN M, et al. Earthworm services for cropping systems. A review[J]. Agronomy for Sustainable Development, 2015, 35(2):1-15.

[7] WANG D, SHI Q, WANG X, et al. Influence of cow manure vermicompost on the growth, metabolite contents, and antioxidant activities of Chinese cabbage (Brassicacampestrisssp.chinensis)[J]. Biology and Fertility of Soils, 2010, 46(7): 689-696.

[8] 王小波,卢树昌,王 瑞，等. 蚯蚓粪与蛭石结合对设施菠菜生长和品质的影响[J].北方园艺, 2014(18): 63-66.

[9] 陈小锦，沈鹏飞，陈博阳，等．不同蚓粪添加量对红壤微生物及酶活性的影响[J]．江苏农业科学，2016,44(11):443-445.

[10] SONG X, LIU M, WU D, et al. Interaction matters: synergy between vermicompost and PGPR agents improves soil quality, crop quality and crop yield in the field[J]. Applied Soil Ecology, 2015, 89: 25-34.

[11] ZHANG S, CHAO Y, ZHANG C, et al. Earthworms enhanced winter oilseed rape (BrassicanapusL.) growth and nitrogen uptake[J]. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2010, 139(4): 463-468.

[12] MOUQUET N, LOREAU M. Community patterns in source-sink metacommunities[J]. The american naturalist, 2003, 162(5): 544-557.

[13] LAVELLE P, DECA⊇NS T, AUBERT M, et al. Soil invertebrates and ecosystem services[J]. European Journal of Soil Biology, 2006, 42(11): 3-15.

[14] DALBY P R, BAKER G H, SMITH S E. ‘Filter paper method’ to remove soil from earthworm intestines and to standardise the water content of earthworm tissue[J]. Soil Biology and Biochemistry, 1996, 28: 685-687.

[15] 李合生. 现代植物生理学[M].3版. 北京: 高等教育出版社, 2012: 355-390.

[16] DUBOIS M, GILLES K A, HAMILTON J K, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry, 1956, 28(3): 350-356.

[17] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254.

[18] EDWARDS C A. The importance of earthworms as key representatives of the soil fauna. In: Earthworm Ecology[M]. Boca Raton, USA : CRC Press, 2004: 3-11.

[19] BLOUIN M, HODSON M E, Delgado E A, et al. A review of earthworm impact on soil function and ecosystem services[J]. European Journal of Soil Science, 2013, 64(2): 161-182.

[20] VAN GROENIGEN J W, LUBBERS I M, VOS H M, et al. Earthworms increase plant production: a meta-analysis[J]. Scientific Reports, 2014, 4(4):6365.

[21] XIAO Z, WANG X, KORICHEVA J, et al. Earthworms affect plant growth and resistance against herbivores: a meta-analysis[J]. Functional Ecology, 2018, 32: 150-160.

[22] 胡 佩，刘德辉，胡 锋，等. 蚓粪中的植物激素及其对绿豆插条不定根发生的促进作用[J]. 生态学报，2002, 22(8):1211-1214.

[23] ZHANG S, HU F, LI H, et al. Influence of earthworm mucus and amino acids on tomato seedling growth and cadmium accumulation[J]. Environmental Pollution, 2009, 157(10): 2737-2742.

[24] SHARMA D K, TOMAR S, CHAKRABORTY D. Role of earthworm in improving soil structure and functioning[J]. Current Science, 2017, 113(6): 1064-1071.

[25] SONG X, LIU M, WU D, et al. Heavy metal and nutrient changes during vermicomposting animal manure spiked with mushroom residues[J]. Waste Management, 2014, 34(11): 1977-1983.