中华鲟TaqMan 实时荧光PCR 检测方法的建立

陈光哲， 郑红霞, 祝长青

(1.江苏省农业科学院中心实验室，江苏 南京 210014； 2.南京农业大学,江苏 南京 210095； 3.江苏出入境检验检疫局，江苏 南京 210001)

鲟类是现存起源最早的脊椎动物之一，是一亿五千万年前中生代留下的稀有古代鱼类，其被誉为研究鱼类和脊椎动物进化的“活化石”。在中国境内，分布着一些野生鲟鱼，其中中华鲟是中国特有的珍贵鲟类，具有重要的科学价值和难以估量的生态、社会、经济价值，有“水中大熊猫”之称[1-5]。但是，近年来，由于水域污染、人为捕捞、水利工程的建设以及资源的过度开采等原因导致了中华鲟的数量急剧减少。中国已经将中华鲟列入《国家重点保护水生野生动物名录》，并按照一级保护野生动物实施保护。2010年，国际自然保护联盟红色名录也收录其为极危物种[6-9]。因此，保护中华鲟迫在眉睫，而建立快速、灵敏、特异的中华鲟及其产品的检测鉴定方法是保护和拯救这一珍稀濒危“活化石”的有效技术措施之一。

近几年来，一些水生生物的物种鉴定方法陆续在国内外研究中被报道，主要包括形态学鉴定[10]、同工酶电泳分析[11]、染色体组型分析[12]、COI基因分析[13]等。这些方法虽已被运用于多种水生生物的鉴定，但是在实际应用中仍然具有一定的局限性。形态学、同工酶鉴定等方法由于受到检测对象需为活体条件的限制，无法应用在水产加工产品上；染色体组型分析、COI基因分析等方法也存在操作繁琐、耗时过长等不足[10-13]。PCR(聚合酶链式反应,Polymerase chain reaction)技术以其灵敏度高、特异性强等优点脱颖而出，在近几十年被全世界许多科研机构和实验室所采用。尤其是实时荧光PCR 技术，实现了PCR技术从定性到定量的飞跃，既可省去普通PCR 检测过程中PCR 产物后续的分析与验证步骤(如凝胶电泳和探针杂交)，简化检测过程，又能够减少试验操作过程中的EB (溴化乙锭Ethidium bromide)污染，使试验更具安全性，同时边扩增边检测，还可以提高检测速度[14-16]。因此，与常规PCR 相比，实时荧光PCR 技术具有准确性高、特异性强、自动化程度高、可有效解决PCR 污染等优势[17-18]，已成为一种成熟的主流基因检测平台，并且应用在诸多领域，如食品安全检验、食品成分来源检验[19]等。

本试验根据NCBI(美国国立生物技术信息中心，National center for biotechnology information)上已经公布的中华鲟D-loop基因的核酸序列，设计并筛选出特异性的引物和探针，建立中华鲟TaqMan实时荧光PCR检测方法，为中华鲟的物种鉴定及种质资源保护提供有效的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 中华鲟供试样品为渔业保护部门提供；西伯利亚鲟、达氏鲟、史氏鲟购自鲟鱼养殖场，其他用于对照试验的动物种类购自于南京农贸市场(表1)。

表1供试样品的种类

Table1Speciesofsamples

序号样品名称序号样品名称序号样品名称序号样品名称1中华鲟13螃蟹25鸡肉37蚌仔2史氏鲟14黄鳝26叉尾鮰鱼38毛蚶3西伯利亚鲟15带鱼27梭鱼39文蛤4河豚16黄颡鱼28牛蛙40斑节虾5蚌17鲈鱼29螯花鱼41小青龙虾6牙鲆18鱿鱼30鲳鱼42单环刺缢7斑马鱼19猪肉31黑鱼43梅蛤8鳖20牛肉32黄鱼44大闸蟹9鲤鱼21羊肉33鳊鱼45虾蛄10河虾22鸭肉34青鱼46青蟹11对虾23江白虾35海蟹47梭子蟹12鲫鱼24花蟹36香螺48克氏原螯虾

1.1.2 菌株和质粒 pMD19-T克隆载体和感受态细胞DH5α，南京钟鼎生物技术有限公司产品。

1.1.3 试剂 Tiangen海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Marine Animals DNA Kit，目录号：DP324)， Tiangen琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANamp Agarose Gel DNA Purification Kit，目录号：DP209)， AxyPrep质粒DNA小量试剂盒(AxyPrep Plasmid Miniprep Kit，目录号：AP-MN-P-50)，普通PCR预混液SapphireAmp Fast PCR Master Mix(宝生物有限公司产品)，实时荧光PCR反应预混液CS qPCR Master Mix(上海辉睿生物科技公司产品)，中华鲟基因引物及探针(上海辉睿生物科技公司产品)。

1.1.4 仪器 NanoDrop 1000微量紫外分光光度计(Thermo Scientific公司产品)，AQE -183-2全自动凝胶成像系统(Syngene公司产品)，LightCycler 480 II实时荧光PCR扩增仪(Roche公司产品)。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 使用Tiangen海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取中华鲟及对照生物的DNA。

1.2.2 引物设计 根据NCBI上公布的中华鲟D-loop基因序列设计引物探针组合，上游引物F：5′- CAAGAACACAAGATTAATGAG -3′,下游引物R：5′- GATCAAGGTATGTCGATGACA -3′，荧光探针P：5′- 荧光基团-CAGTCCTGCTTTTGGGGTTCGGCAAG-淬灭基团-3′，荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1。

1.2.3 重组质粒构建 以中华鲟DNA为模板，利用引物对其进行PCR扩增。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，应用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的产物，将目的DNA片段经TA克隆连接至pMD19-T载体中，得到重组质粒。重组质粒转化到感受态细胞DH5α内增殖，筛选阳性克隆，进行菌液PCR检测，取约100 μl阳性克隆菌液送南京钟鼎生物技术公司测序，以确定克隆片段序列的准确性。使用质粒提取试剂盒提取重组质粒，根据下列公式计算拷贝数：拷贝数=(质粒质量×6.02×1023)/(质粒分子碱基对数×324.50×2.00)。

1.2.4 TaqMan实时荧光PCR TaqMan实时荧光PCR反应体系为10 μmol/L上游引物1.0 μl，10 μmol/L下游引物1.0 μl，10 μmol/L探针0.6 μl，50 ng/μl DNA模板2.2 μl,2倍荧光PCR缓冲液12.5 μl，去离子水9.0 μl。反应体系终浓度为1倍荧光PCR缓冲液，上游引物0.40 μmol/L，下游引物0.40 μmol/L，探针0.24 μmol/L。反应条件为：预变性95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 40 s，45个循环，在每次循环的退火延伸时收集荧光信号；40 ℃冷却 30 s。反应结束后，运用配套软件进行分析。

1.2.5 特异性评定 以中华鲟及对照生物的DNA为模板，并设置空白对照，进行TaqMan实时荧光PCR反应。

1.2.6 灵敏度测定

1.2.6.1 核酸浓度 以浓度为1.0×10-5ng/μl、 1.0×10-4ng/μl、1.0×10-3ng/μl、1.0×10-2ng/μl、1.0×10-1ng/μl 的中华鲟DNA为模板，设置空白对照，进行TaqMan实时荧光PCR扩增。

1.2.6.2 重组质粒 以每1 μl拷贝数达到1个拷贝、101个拷贝、102个拷贝、103个拷贝、104个拷贝的重组质粒DNA为模板，并设置空白对照，应用建立的TaqMan实时荧光PCR检测方法进行扩增。

1.2.7 TaqMan实时荧光PCR检测方法的验证 将本研究建立的实时荧光PCR检测方法应用于全国多个省市采集的63个鲟鱼样品，以验证该方法的特异性和灵敏度。

2 结果与分析

2.1 重组质粒的构建

对重组质粒进行克隆与测序，克隆片段序列与NCBI上中华鲟的D-loop基因序列比对，结果显示能够准确扩增出长度为489 bp的中华鲟D-loop基因，并且扩增片段成功与质粒载体连接形成长度为3 181 bp的重组质粒。重组质粒克隆片段测序结果如下：GATCAAGGTATGTCGATGACAAGTCAGTCCTGCTTTTGGGGTTCGGCAAGAAATATAGGGCCTGTCCGACATAAGGGGGTAGGGGGTTTGTCGACAATAAACGCCCGCACCTCGAAGTTCATGTGGGGAGGCAAAATCAGGTCTTGTAAAACACTCTCATGTGTGGATGTTAGATATATGTCCTTGCATCATTCATTATTCATTCCTCCGAGCAGTTGTGTAATGTTCTACCTTGTTGTTCTTTTCTGAAGGAGTTCTACATGTCAGTGAATGGAAACCCAGATTAAAAGTGCCAAATGTTGACAAGATTCTTGGCATGTGGGGTCATGGATTTTACAGTATTTTTAACATCAATCATATGCCAGACATAGTTCAGTTATGGGGAGTTTAACTATTAATGGGCCTGAGATAGAAGCCAAATGCCAGTAATAGTTCAATTTTAGGTCTTTTACAGGTACTGTCCTTCATCTCATTAATCTTGTGTTCTTG提取的重组质粒DNA利用NanoDrop 1000 微量紫外分光光度计测定DNA的纯度和浓度，DNA的A260/A280平均值为1.77，DNA的平均浓度为2 789.3 ng/μl。重组质粒DNA的浓度稀释至28.0 ng/μl，根据公式计算拷贝数，相当于1 μl溶液中含有 8.16×109拷贝重组质粒DNA，用超纯水将重组质粒溶液稀释成1 μl 108个拷贝， -20 ℃保存备用。

2.2 特异性

F-R-P引物/探针组合对试验所检测各物种的特异性试验结果显示，当使用引物和探针组合F-R-P对48种DNA样本进行扩增时，只有在中华鲟的DNA样本出现扩增曲线，而在其他物种中没有出现扩增曲线。因此建立的中华鲟TaqMan实时荧光PCR检测方法具有高度的特异性。

2.3 灵敏度

2.3.1 核酸浓度 应用建立的中华鲟TaqMan实时荧光PCR检测方法对倍比稀释的中华鲟DNA进行扩增，结果见表2。试验结果显示中华鲟TaqMan实时荧光PCR检测方法灵敏度可达到1.0×10-3ng中华鲟DNA。

表2中华鲟TaqMan实时荧光PCR体系的灵敏度(核酸浓度)的Ct值

Table2TheCtvalueofsensitivityofTaqManreal-timePCRsystemforAcipensersinensis(theconcentrationofnucleicacids)

NDA质量(ng)Ct值0．1000029．360．0100032．750．0010034．770．00010-0．00001-空白对照-

2.3.2 重组质粒 应用建立的F-R-P检测体系对重组质粒DNA进行灵敏度的检测，扩增检测结果见表3。试验结果显示中华鲟TaqMan实时荧光PCR检测方法灵敏度可达到100拷贝的重组质粒DNA。

2.4 检测方法的验证

将本研究建立的中华鲟TaqMan实时荧光PCR检测方法应用于全国多个地区采集的63个鲟鱼样品中，检测结果显示：许多餐馆中号称的“中华鲟”其检测结果不是真正的中华鲟，而只是其他的一些鲟鱼品种。其中7个从相关科研单位得到已经鉴定的中华鲟标本，经检测才是真正的中华鲟，检测曲线图谱如图1所示。

表3中华鲟TaqMan实时荧光PCR体系的灵敏度(重组质粒)的Ct值

Table3TheCtvalueofsensitivityofTaqManreal-timePCRsystemforAcipensersinensis(recombinantplasmid)

重组质粒拷贝数Ct值1000030．68100033．9910038．9510-1-空白对照-

图1 部分鲟鱼样品的检测曲线Fig.1 The amplification curves of some sturgeon samples

3 讨 论

目前建立的中华鲟物种鉴定方法主要包括形态学鉴定、同工酶电泳分析、染色体组型分析、COI基因分析等方法，然而上述方法均存在某些局限性，不能对中华鲟及其产品进行快速而准确的检测。因此为给中华鲟提供及时而有效的保护，建立中华鲟及其产品的快速检测方法是十分必要的。

实时荧光PCR技术在近年来发展迅速，已成为目前应用较为广泛的一种检测方法。实时荧光PCR技术中常用的荧光材料有SYBR Green染料、TaqMan探针、分子信标、荧光共振能量传递(FRET)探针、复合探针等[20]。其中，TaqMan探针是一种水解寡核苷酸探针，其序列与目标序列上下游引物之间的一段DNA模板完全互补，5′端标记报告荧光基团(Reporter)，3′端标记淬灭荧光基团(Quencher)，每扩增1条DNA链，就会有1个TaqMan探针被水解下来，并随之释放出一个荧光信号，荧光信号的积累与PCR产物的增加是同步进行的[20]。TaqMan实时荧光PCR检测技术能够避免非特异性产物与探针的杂交，从而保证了检测特异性[21]。目前该技术已经在多种动植物物种及其产品的鉴定方面得到了成功的应用[22]。

D-loop区是线粒体基因组上DNA序列和长度变异最大的一段非编码区，各个物种的D-loop基因具有较好的特异性[23]。本研究根据NCBI上公布的中华鲟D-loop基因序列，应用分子生物学软件设计并筛选出相应的引物和探针组合，经过TaqMan实时荧光PCR扩增和克隆测序，设计的引物和探针组合能够特异、高效地扩增靶序列，扩增产物(长度为489 bp)测序结果与 NCBI上中华鲟D-loop基因序列一致。

本研究所建立的中华鲟TaqMan实时荧光PCR检测方法，应用于大量实际样品后的试验结果均符合预期，充分证实了该方法可以应用于中华鲟的物种鉴定，该检测方法特异性好、灵敏度高、可操作性强，具有较好的应用和推广价值，可以为中国中华鲟的鉴别以及物种资源保护工作提供可靠的技术支撑。

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