牛副流感病毒3型RT-PCR方法的建立及初步应用

王 吉, 付 瑞, 李晓波, 王淑菁, 王莎莎, 李 威, 秦 骁, 巩 薇, 岳秉飞, 贺争鸣

(中国食品药品检定研究院 国家实验动物微生物遗传检测中心, 北京 100050)

牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type3, BPIV3) 属副黏病毒科(paramyxoviridae)副黏病毒亚科(paramyxovirinae)呼吸道病毒属(respirovirus)成员，为单链负股有囊膜的RNA病毒[1]。1959年Reisinger等[2]和Hoerlein等[3]在美国的牛体中首次分离到BPIV3，同时在这些动物中查出了该病毒的抗体[2-4]。目前，BPIV3广泛流行于世界各国，在美洲、欧洲、亚洲各国均不断发生或流行[4]。血清学调查结果显示BPIV3在我国流行比较广泛[4]。以支气管炎、肺炎等呼吸道症状为主要特征[4,5]。严重威胁养牛业的健康发展。同时BPIV3也是一种重要的人兽共患病毒[1]，不仅对饲养人员造成威胁，而且通过潜在污染人用牛源性产品对人民用药安全造成潜在威胁。

随着生物医药生产技术的迅猛发展，动物源性生物制品的开发利用日益增多，尤其是牛源产品及副产品的生产应用越来越广泛，同时伴随着科技及对药品生物制品质量发展的要求，人们对牛源性制品是否携带或潜在病毒污染，尤其是可直接对人民用药安全造成威胁的人兽共患病毒越来越关注。为保障人民用药安全及避免传染病的扩散，最大限度地降低使用牛源性产品传播牛携带BPIV3的风险,本实验建立了快速、特异、敏感的BPIV3 RT- PCR方法，用于对牛及人用牛源性制品及原材料可能携带或潜在BPIV3 的检测，对保证牛源材料及牛源产品的使用安全性、保障人民用药安全非常重要。

1 材料与方法

1.1 病毒及样品

BPIV3、传染性牛鼻气管炎病毒(bovine herpesvirus type 1, BHV-1)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)、购自美国标准生物品收藏中心 (ATCC)(编号分别为VR-281、VR-188、VR-1422); 仙台病毒(Sendai virus，SV)由本室保存;12批次小牛血清去蛋白注射液和脾多肽注射液(编号NY1～NY12)由国内3个厂家提供，64份牛血浆样本(编号分别为X1～X61)由北京某单位提供，61份牛鼻拭子样本(编号分别为b1～b61)由内蒙古自治区某单位提供。

1.2 主要试剂

DNA/RNA快速提取试剂盒购自德国Qiagen公司; 逆转录试剂盒购自美国Promega公司; Taq DNA聚合酶和100 bp DNA marker均购自日本TaKaRa公司; PCR仪和核酸琼脂糖凝胶电泳仪均购自美国Bio-RAD公司(PwerPac Basic); 凝胶成像分析仪购自美国Kodak公司(GL212Pro)。

1. 3 引物设计及合成

分析已报道的BPIV3序列，选择神经氨酸酶(HN)基因保守区域作为靶基因。根据GenBank中登陆的BPIV3HN基因(序列号: AF178655.1)，用Primer Premier 5.0软件设计2组引物(表1)。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

表 1 用于扩增HN2基因的引物序列及位置Table 1 Used for amplification HN2 gene primer sequence and position

1.4 病毒DNA提取

对正常牛肾细胞(bovine kidney cells，MDBK细胞)、BPIV3感染MDBK细胞毒、BVDV、BHV-1、SV，按照DNA/RNA快速提取试剂盒操作方法进行DNA/RNA提取。提取的DNA样本冻存于-70 ℃冰箱备用。提取的RNA样本立即进行cDNA合成。

1.5 PCR检测方法的建立及引物的筛选

以获得的cDNA为模板进行PCR扩增。对2组引物PCR反应体系的dNTPs浓度、10×Buffer浓度、Taq HS酶浓度、引物、模板量、及反应体系的退火温度及循环次数等进行优化，通过对正常MDBK细胞、BPIV3感染MDBK细胞毒的进行PCR扩增来确定PCR反应的最佳模式及最佳引物。

1.6 PCR产物的检测

取5 μL扩增产物经质量分数1.0%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。电泳缓冲液为1×TAE(0.04 mol/L Tris乙酸，0.001 mol/L EDTA，pH8.0)，110 V电泳30 min，在紫外成像仪下观察PCR产物条带在凝胶中的位置，以100 bp DNA ladder Marker为参照物，判定结果。PCR阳性扩增片段进行测序，通过与Genbank 中BPIV3序列进行比对以确定PCR检测的准确性[7]。

1.7 特异性的试验

在方法建立及最佳引物筛选的基础上，分别以BPIV3感染MDBK细胞毒、BVDV、BHV-1、 SV及正常MDBK细胞的DNA/cDNA为模板，用筛选出的最佳引物2(HN2)建立的PCR方法进行扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳做初步鉴定。

1.8 敏感性的试验

取感染滴度为6.5 lgTCID50/mL BPIV3病毒液，用PBS做10倍梯度稀释，分设原液到10-6共7个稀释度。取每个稀释度病毒液各0.2 mL制备模板，用引物2分别进行PCR扩增，扩增产物经质量分数1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，确定所能检测病毒最小滴度[7]。

1.9 稳定性和重复性实验

取10-3～10-5BPIV3 cDNA及同一批PCR检测试剂在-30 ℃冰箱放置12个月时，用引物2进行PCR检测，每个稀释梯度cDNA各做3个重复。扩增产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳鉴定[7]。

1.10 应用

取12份牛源性制品样本(12份小牛血清去蛋白注射液和脾多肽注射液样本编号: NY1～NY12)、64份牛血浆样本(编号: X1～X64)、61份牛鼻拭子样本(编号: b1～b61)、及正常MDBK细胞与BPIV3同时提取RNA, 逆转录cDNA 用引物2进行PCR扩增。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳做初步鉴定。

扩增到的阳性样品进行测序鉴定。测序结果经BLAST分析，与GenBank中BPIV3核酸序列进行比对，验证检测结果的准确性。

2 结果

2.1 PCR检测方法的建立

2.1.1 最佳反应条件的确定 通过对2组引物PCR反应条件及反应体系的优化，确定了PCR最佳反应体系为: 10 × ExTaq Buffer(含 Mg2+) 2 μL, dNTPs Mixture(10 mmol/L) 2 μL, Taq HS酶(5 U/μL) 0.5 μL,上下游引物(10 pmol/μL)各 1 μL, DNA 2 μL，补水至20 μL; PCR最佳反应条件为: 94 ℃预变性5 min;94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 1 min, 共35个循环; 72 ℃再延伸5 min。

2.1.2 最佳引物的确定 2组引物以BPIV3为模板进行扩增，HN1和HN2引物均有明显目的条带出现，但HN2较HN1扩增效果更好(图1)，因此选择HN2引物建立RT-PCR检测方法。

2.2 方法的特异性实验

HN2引物特异性实验显示以BPIV3 cDNA为模版有明显的目的条带出现，以BVDV、BHV-1、SV及正常MDBK细胞的DNA/cDNA为模板，均无目的条带出现(图2)。

2.3 方法检测结果的准确性

选择引物2 PCR扩增BPIV3阳性片段进行测序,测序结果经BLAST分析, 与GenBank中BPIV3核酸序列同源性为99%, 说明该方法检测准确性较好(图3)。

图 1 引物筛选结果Figure 1 The results of primers screening

图 2 引物2 特异性条件验证Figure 2 Specific validation results of primer 2

图 3 引物2 PCR扩增BPIV3阳性片断与GenBank中BPIV3毒株序列比对结果Figure 3 The comparison results of primer 2 PCR BPIV3 positive amplification fragment with BPIV3 in GenBank

2.4 方法敏感性试验

通过图4敏感性结果显示，引物2检测病毒滴度均可以达到6 lgTCID50/mL。

2.5 方法稳定性和重复性实验

电泳结果显示, 10-3～10-5BPIV3 cDNA 在-30 ℃冰箱放置12个月时，用引物2进行检测，仍能扩增出约610 bp明显可见目的条带(图5)。

图 4 引物2 PCR检测敏感性测定-BPIV3细胞毒浓度梯度Figure 4 The sceptibility testing results of RT-PCR using primers 2-cytotoxic concentration gradient of BPIV3

图 5 引物2 PCR稳定性测定Figure 5 The repeatability and stability testing results of PCR using primers 2

2.6 初步应用

2.6.1 牛血浆检测 利用引物2建立的PCR检测方法, 对64 份牛血浆样本(编号: X1～X64)进行检测。电泳结果显示有11份样本(编号为: X4、X6、X8、X13、X19、X20、X29、X35、X40、X42、X62)扩增到约610 bp的可见目的条带, 其他53份牛血浆样本均未扩增到可见目的条带(图6～图8)。

图 6 PCR方法检测21份牛血浆样本(X1～X21)电泳结果Figure 6 The results of Primers 2 PCR to detect 21 bovine plasma samples (X1～X21)

图 7 PCR方法检测22份牛血浆样本 (X22～X43) 电泳结果Figure 7 The results of Primers 2 PCR to detect 22 bovine plasma samples (X22～X43)

2.6.2 牛鼻拭子检测 利用引物2建立的PCR检测方法, 对61 份牛鼻拭子样本(编号分别为b1～b61)进行检测。电泳结果显示, 有9份牛鼻拭子样本(编号为: b7、b10、b16、b44、b51、b53、58、b59、b60)扩增到约610 bp的可见目的条带; 其他52份牛牛鼻拭子样本均未扩增到可见目的条带(图9、图10)。b22～b40检测结果均为阴性(电泳结果图略)。

2.6.3 牛源性制品检测 利用引物2建立的PCR检测方法，对12份牛源成品样本(样本编号: NY1～NY12)检测，结果均为阴性(电泳结果图略)。

2.6.4 检测结果的验证 将BPIV3核酸检测阳性的样本 X4、X6、X8、X13、X19、X20、X29、X35、X40、X42、X62和b7、b10、b16、b44、b51、b53、58、b59、b60扩增产物测序，与GenBank中BPIV3标准株核苷酸序列进行比对，其同源性均在95% 以上。检测137份样本BPIV3核酸阳性率为14.6%。

3 讨论

图 8 PCR方法检测21份牛血浆样本 (X44～X64) 电泳结果Figure 8 The results of Primers 2 PCR to detect 22 bovine plasma samples (X22～X43)

图 9 PCR方法检测21份牛鼻拭子样本(b1～b21)电泳结果Figure 9 The results of primers 2 PCR to detect 21 bovine nasal secretions samples (b1～b21)

图 10 PCR方法检测21份牛鼻拭子样本 (b41～b61) 电泳结果Figure 10 The results of primers 2 PCR to detect 21 bovine nasal secretions samples (b41～b61)

BPIV3作为一种接触性人兽共患病毒[5,7], 是构成牛呼吸道综合征(bovine respiratory disease complex,BRDc)的主要病毒[8]。不仅感染人和牛，同时还可感染猪、骆驼等动物[9,10]。虽然目前国内外已有BPIV3 PCR检测方法建立的报道[11-13]，但均没有推广应用, 尤其是针对牛源产品及原辅材料外源BPIV3的检测还未有报道。中华人民共和国药典亦没有关于牛源制品及原辅材料检测的规定[14]。药典在“新生小牛血清检测”中虽然有关于新生牛血清用细胞接种法和免疫荧光法检测病毒的规定[14], 但没有更为敏感特异的分子生物学检测方法，针对人用牛源性材料及人用牛源性生物制品的检测还是空白。

本研究检测了国内5个厂家牛源性样本(包括小牛血清去蛋白提取液、脾多肽注射液、牛血浆、牛鼻拭子等)137批次。其中检测国内3个厂家小牛血清去蛋白注射液12批次，结果均为阴性;检测北京某单位64份牛血浆样本阳性率为17.2%(11/64); 检测内蒙古自治区某单位61份牛血浆样本阳性率为14.8%(9/61); 感染率与文献报道相符[15,16]。137批次样本BPIV3核酸检出率为14.6%。实验通过对可见的特异性目的条带进行纯化测序，证明20个有可见目的条带的样本为BPIV3。这也充分显示了普通PCR在结果确认上可以通过测序验证的优点。从检测结果看，牛源材料样本中确实携带BPIV3，对人用牛源性制品构成潜在的危险。

为了保障用药的安全, 最大限度地降低使用牛源性生物制品传播牛携带相关病毒的风险，本实验室建立了特异、敏感、操作简单的RT-PCR方法,用于牛、人用牛源性生物制品以及用于生产牛源制品的原材料，如牛血浆、牛组织、牛源细胞等携带或潜在污染BPIV3的检测, 不仅完善了BPIV3的检测技术, 为研发BPIV3 RT-PCR检测试剂盒奠定了基础, 也为今后制定相关技术的国家标准及药典的完善、在全国范围内推动牛源制品生产企业开展牛源制品及原辅材料BVDV检测提供了技术支撑。

参考文献：

[1] 周玉龙, 任亚超, 朱战波, 等. 牛副流感病毒3型HN基因原核表达及间接ELISA方法建立[J].病毒学报, 2012, 28(1):23-28.

[2] Reisinger RC, Heddleston KL, Manthhei CA, et al. A myxovirus (SF-4) associated with shipping fever of cattle[J].J Am Vet Med Assoc, 1959, 135(3):147-152.

[3] Hoerlein AB, Mansfield ME,Abinanti FR, et al. Studies of shipping fever of cattle.I.Parainfluenza 3 virus antibodies in feeder calves[J]. J Am Vet Med Assoc, 1959, 135(3):153-160.

[4] 徐子晟, 朱远茂. 我国牛副流感病毒3型的研究进展[J]. 中国奶牛, 2016(4):32-34.

[5] Horwood PF, Mahony TJ. Multiplex real-time RT-PCR detection of three viruses associated with the bovine respiratory disease complex[J]. J Virol Methods, 2011, 171(2):360-363.

[6] 王吉, 付瑞, 卫礼, 等. 猫细小病毒PCR检测方法的建立及初步应用[J].实验动物科学, 2015, 32(1):1-6.

[7] 杨建乐, 赵贵民, 侯佩莉, 等. 牛副流感病毒3型抗体间接ELISA测方法的建立与初步应用[J]. 动物医学进展, 2016,37(11):19-24.

[8] 王海勇, 童钦, 王 炜, 等. 我国牛副流感病毒 3 型血清学调查[J]. 中国预防兽医学报, 2014, 36(2):154-156.

[9] Newcomer BW, Neill JD, Galik PK, et al. Serologic survey for antibodies against three genotypes of bovine parainfluenza 3 virus in unvaccinated ungulates in Alabama[J]. Am J Vet Res,2017, 78(2):239-243.

[10] Wang FX, Liu Y, Zhu HW, et al. Safety of inoculation of bovine parainfluenza virus 3 as potential vaccine vector in pigs[J].Virus Disease, 2015, 26(1-2):89-91.

[11] 刘晓乐, 张敏敏, 陈颖钰, 等. 牛副流感病毒 3 型 RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国奶牛, 2011(22):1-3.

[12] 王嵩, 林红丽, 王字鹏, 等. BRSV和BPIV-3双重PCR检测方法的建立及初步应用 [J] . 黑龙江八一农垦大学学报,2014, 26(5):35-38.

[13] Kishimoto M, Tsuchiaka S, Rahpaya SS, et al. Development of a one-run real-time PCR detection system for pathogens associated with bovine respiratory disease complex[J]. J Vet Med Sci, 2017, 79(3): 517-523.

[14] 陈竺, 邵明立, 吴浈, 等. 中华人民共和国药典[S]. 2015 年版 三部 (通则), 新生牛血清检测要求, 通则:144.

[15] 倪宏斌, 剡根强, 张坤, 等. 新疆部分地区牛副流感病毒3型的检测与基因分型[J]. 畜牧与兽医, 2016, 48(12):72-75.

[16] 罗玉江, 李 静, 苏贵成, 等. 奶牛场主要病毒性繁殖障碍疫病感染情况调查[J]. 中国动物检疫, 2015, 32(6):15-17.