榆黄菇遗传多样性的ISSR和SRAP综合分析

武海月 赵爽 刘宇 李华敏 宋爽 牛玉蓉 荣成博

（1. 北京市农林科学院植物保护环境保护研究所 北京市食用菌工程技术研究中心，北京 100097；2. 农业部都市农业（北方）重点实验室，北京 100097；3. 北京农学院资源与环境系，北京 102206；4. 鲁东大学食品工程学院，烟台 264025）

榆黄菇（Pleurotus citrinopileatus）又名金顶侧耳、金顶蘑，属担子菌门（Basidiomycota），层菌纲（Hymenomycetes），伞菌目（Agaricales），口蘑科（Tricholomataceae）， 侧 耳 属（Pleurotus（Fr.）Quel.）［1］。其味道鲜美，营养丰富，含蛋白质、维生素和矿物质等多种营养成分，其中氨基酸含量尤为丰富，且必需氨基酸含量高［2］。榆黄菇属高营养、低热量食品，长期食用，有降低血压、降低胆固醇含量的功能，是老年人心血管疾病患者和肥胖症患者的理想保健食品［3］。

榆黄菇的人工栽培开始于20世纪70年代，现在已经能够进行周年栽培。但是到目前为止，在栽培上大都将采集的野生菌株直接用于生产，或者经过筛选驯化后作生产用菌种，新品种选育的报道较为少见［4］。食用菌种质资源是优良品种育种的基础材料，育种成效除了取决于掌握种质资源的数量，还很大程度取决于对这些种质资源多样性的遗传特性掌握。分子标记作为食用菌遗传多样性研究中的一个重要手段，其应用越来越广泛［5］。

ISSR 是由 Zietkeiwitcz等［6］1994年创建的一种简单重复序列间扩增多态性分子标记，结合了RAPD和SSR方法的优点，是一种具有稳定性和高重复性的分子标记方法，被广泛应用于食用菌方向［7-8］。SRAP是一种由美国加州大学Li等［9］开发的分子标记技术，通过独特的双引物设计，利用上游引物针对外显子区域，下游引物对内含子区域和启动子区域进行特异性扩增，上游引物和下游引物自由结合，配对出不同组合进行反应。由于物种及个体间的差异导致内含子、启动子和间隔序列不同进而产生多态性。

由于每一个方法的开发原理不同，聚类分析结果通常会存在较大的差异，将多个分子标记综合运用能最大优化聚类分析结果。目前，榆黄菇还没有系统的遗传多样性分析，鉴于此，本研究采用ISSR和SRAP两种分子标记的方法，对收集自全国19个榆黄菇菌株进行遗传多样性研究，旨为榆黄菇的分类鉴定、遗传育种和种质资源保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 本研究所用菌株的名称及来源参见表1。

1.1.2 试剂及培养基 马铃薯葡萄糖琼脂粉（BD Difco），蛋白胨（OXIOD），分析纯磷酸二氢钾、硫酸镁等化学试剂，均购自国药集团北京化学试剂公司；2×TaqPCR MasterMix购自北京艾德莱生物科技有限公司；琼脂糖购自西班牙Biowest公司；所有引物由上海生工生物公司（Sangon）合成。PDA综合培养基：马铃薯葡萄糖琼脂粉40 g、硫酸镁1.5 g、磷酸二氢钾3 g、VB110 mg、水1 000 mL。

表1 供试菌株及其来源

1.1.3 仪器 PCR仪（Eppendorf Mastercycler Gradient）、凝胶成像系统（Bio-Rad）、紫外可见分光光度计（Labtech UV9100）、电泳仪（北京六一DYY-Ⅲ-12B）、电子分析天平（奥豪斯）、台式高速冷冻离心机（Eppendorf 5415R）、移液器（Eppendorf）等。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增 取在PDA平板上活化7-10 d的榆黄菇菌种，刮取少量菌丝作为实验材料，DNA的提取参照许峰等［10］方法。ISSR扩增反应体系及扩增程序参照冯伟林等［11］方法，ISSR-PCR反应的总体积为 25 μL，体系为 ：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，0.4 μmol/L 引 物（1 μL），20-50 ng DNA（1 μL），加灭菌双蒸水（10.5 μL）至 25 μL。将反应液按上述体积加入0.2 mL 离心管中，混匀，放入PCR仪中，进行PCR扩增。

ISSR-PCR程序设定：94℃预变性4 min，然后94℃变性30 s，以低于引物Tm值温度5℃复性45 s，72℃延伸2 min，共35个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。

SRAP扩增反应体系及扩增程序参照边银丙等的方法［12］，SRAP-PCR 反应的总体积为 25 μL，体系 为 ：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，0.4 μmol/L引物 R（1 μL）、引物 F（1 μL），20-50 ng DNA（1 μL），加灭菌双蒸水（9.5 μL）至 25 μL。将反应液按上述体积加入0.2 mL 离心管中，混匀，放入PCR仪中，进行PCR扩增。

SRAP-PCR程序设定：94℃预变性7 min，94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸2 min，5个循环；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸90 s，共38个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

取8 μL PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳（2%），置于紫外凝胶成像系统上观察并拍照记录。（所用引物参见表2-3）

表2 ISSR分析用引物

1.2.2 数据处理及分析 上述电泳图谱中同一水平上将扩增出的强带或分辨性好的弱带，均视为扩增阳性，并赋值“1”，未扩增出条带视为扩增阴性，赋值“0”，用NTSYSpc 2.10软件进行聚类分析。

2 结果

2.1 供试菌株ISSR分析结果

以提取的19个供试榆黄菇菌株的基因组DNA为模板，通过对不同引物的PCR扩增筛选，选出10条引物（表2）在供试菌株上扩增效果良好，每个菌株都可以通过PCR扩增出DNA条带，且条带稳定、清晰、重复性好、分布合理。10条引物共扩增出102条DNA片段，其中多态性条带为80个，多态性为78.4%（表4）。

表3 SRAP分析用引物

不同引物扩增出的DNA条带数不等，其序列长度大多为200-2 000 bp，其中包含了丰富的DNA多态信息（图1-图2）。

2.2 供试菌株SRAP分析结果

以提取的19个供试榆黄菇菌株的基因组DNA为模板，通过对不同引物的PCR扩增筛选，获得的10对引物（表3）在供试菌株上扩增效果良好，每个菌株都可以通过PCR扩增出DNA条带，且条带稳定、清晰、重复性好、分布合理。10对引物共扩增出92条DNA片段，其中多态性条带为70条，多态性为76.1%（表5）。

不同引物扩增出的DNA条带数不等，其序列长度大多为200-2 000 bp，其中包含了丰富的DNA多态信息（图3-图4）。

2.3 供试菌株聚类分析结果

综合20条引物扩增出的194条DNA片段，其中多态性条带150条，多态性达77.3%。用NTSYSpc 2.10软件对19个榆黄菇供试菌株进行聚类分析，获得各菌株间的聚类图（图5）。

根据聚类分析结果可知，在相似系数为0.70水平上，可将19个供试榆黄菇菌株分为4大类，表明19个供试榆黄菇菌株间具有较大的遗传差异，第一类包括01号、03号、04号、06号，第二类包括02号、05号、11号、12号、15号、16号、17号，第三类为13号，第四类包括07号、08号、09号、10号、14号、18号、19号；而在 0.96的相似值水平上，除09号和10号两个菌株未区分开外，其余17个菌株均可单独分开。

表4 ISSR多态性

图1 引物P4对19株榆黄菇菌株的扩增结果

3 讨论

食用菌菌种的鉴定和保护是食用菌产业的重要问题，市场上常出现“同名异物“或”同物异名”的现象，不仅不利于育种者的积极性也给生产者带了巨大的经济损失［4］。传统的菌种鉴别是在子实体层次对子实体的颜色、大小、朵型等形态特征及其生理生化反应特征、栽培特性等为依据，易受生长环境的影响，一般只能鉴定到属内种间这一水平，而对于种内菌株却难以鉴别，且整个鉴定流程时间长、准确率低［3］。

表5 SRAP多态性

图2 引物826对19株榆黄菇菌株的扩增结果

图4 引物me2/em2 对19株榆黄菇菌株的扩增结果

图5 19个榆黄菇菌株的聚类分析图

近年来，随着分子生物学技术的发展，已有多种分子标记技术（RAPD，ISSR 和 SRAP）应用于食用菌的分类鉴定［13］。周洁等［8］利用11个ISSR引物对40个姬菇杂交菌株及2个亲本菌株进行分析，分析结果表明，42个供试菌株遗传相似系数变异范围为0.428 6-0.853 7，在相似系数0.668 0时，42个菌株聚为7类，两亲本各具一类，杂交菌株与亲本菌株遗传差异较大。许峰等［10］利用9对SRAP引物对22个白色金针菇进行聚类分析，在相似系数0.820水平时，将供试菌株分为5大类，技术揭示了北京地区金针菇菌株的遗传多样性。张静等［14］运用SRAP，ISSR和RAPD技术对40个双胞蘑菇进行分析，其中SRAP平均多态率为70.21%；ISSR平均多态率为78.33%；RAPD平均多态率为61.94%，根据距离值不同，将40个双孢蘑菇分为6个或9个类群，更好的解释供试菌株间的亲缘关系。目前国内的分子标记技术在香菇［15］、木耳［16］等食用菌方面应用较广泛，但榆黄菇的报道较少，张秋胜等［17］和崔丹等［18］仅运用ISSR技术分析榆黄菇的遗传多样性。由于每一个方法的开发原理不同，聚类分析结果通常会存在比较大的差异，将多个分子标记综合运用能最大优化聚类分析结果［19］。

本实验共收集了不同地区的19个榆黄菇品种，通过ISSR和SRAP两种分子标记技术，利用筛选的引物以19个供试榆黄菇菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，一共扩增出194条DNA片段，其中，多态性条带有150个，多态性比例为50%-100%不等，平均为77.3%，说明19种榆黄菇遗传多样性比较丰富，可以利用和开发的菌种资源较多；不同引物扩增出每种DNA的条带数量不等，为3-13条，扩增出的DNA片段的分子量大多为200-2 000 bp，包含了丰富的多态性。聚类分析结果表明：19株榆黄菇菌株间的遗传相似系数范围为0.67-0.95，在相似系数为0.70水平上，可将19个供试榆黄菇菌株分为4大类。7号和8号菌株同是引自山东莒县的菌株，聚类分析结果中聚为一簇，说明榆黄菇品种存在一定的地域性；11号和16号是来自不同地区的品种，亲缘关系虽然较近，但是仍然存在一定的差异，说明不是一个品种或同一品种通过不断的传代已经发生遗传变异；通过目前的手段没有能够区分9号和10号菌株，说明二者的亲缘关系很近，且两种菌株都是来自于江苏高邮，可能是同物异名。

本研究应用分子标记技术从DNA水平上系统分析评估榆黄菇种质资源的遗传多样性，为榆黄菇种质资源的鉴定、保护和育种提供了理论支持。

4 结论

本实验筛选出适合供试榆黄菇菌株的10条ISSR引物和10对SRAP引物，利用筛选的引物以19个供试榆黄菇菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，一共扩增出194条DNA片段，其中，多态性条带有150个，多态性比例为50%-100%不等，平均为77.3%，说明19个榆黄菇遗传多样性比较丰富；不同引物扩增出每种DNA的条带数量不等，为3-13条，扩增出的DNA片段的分子量大多为200-2 000 bp，包含了丰富的多态性。聚类分析结果表明：在相似系数为0.70水平上，可将19个供试榆黄菇菌株分为4大类，表明19个供试榆黄菇菌株间具有较大的遗传差异。

［1］ 熊芳, 郑闽江, 刘新锐, 等. SCAR标记技术鉴别榆黄蘑品种［J］.基因组学与应用生物学, 2010（3）：593-597.

［2］ 王玥玮, 王麒琳, 张立娟. 榆黄蘑营养成分及其生物活性的研究进展［J］. 食品研究与开发, 2017, 38（4）：201-203.

［3］ 潘春磊, 王延锋, 黄文, 等. 榆黄蘑10个菌株的农艺性状筛选及评价［J］. 中国食用菌, 2015（6）：13-16.

［4］ 张玉铎. 榆黄蘑单孢杂交及后代筛选［D］. 保定：河北农业大学, 2010.

［5］ 吴学谦, 李海波, 魏海龙, 等. SCAR分子标记技术在香菇菌株鉴定上的应用研究［J］. 菌物学报, 2005, 24（2）：259-266.

［6］ Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification［J］. Genomics, 1994, 20（2）：176-183.

［7］ Liu J, Wang ZR, Li C, Bian YB, Xiao Y. Evaluating genetic diversity and constructing core collections of ChineseLentinula edodescultivars using ISSR and SRAP markers［J］. Journal of Basic Microbiology, 2015, 55（6）：749-760.

［8］ 周洁. ISSR分子标记在姬菇杂交菌株鉴定中的应用［D］. 雅安：四川农业大学, 2010.

［9］ Li G, Quiros CF. Sequence -related amplified polymorphism（SRAP）, a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging inBrassica［J］.Theoretical and Applied Genetics, 2001, 103：455-461.

［10］ 许峰, 刘宇, 王守现, 等. 北京地区白色金针菇菌株的SRAP分析［J］. 中国农学通报, 2010, 26（10）：55-59.

［11］ 冯伟林, 蔡为明, 金群力, 等. ISSR分子标记分析杏鲍菇菌株遗传差异研究［J］. 中国食用菌, 2009, 28（1）：47-49.

［12］ 边银丙, 宋小亚. 几种新型DNA分子标记及其在食用菌研究中的应用［J］. 食用菌学报, 2006, 13（1）：78-81.

［13］ 张瑞颖, 胡丹丹, 左雪梅, 等. 分子标记技术在食用菌遗传育种中的应用［J］. 中国食用菌, 2011（1）：3-7.

［14］ 张静, 陈文炳, 邵碧英, 等. 双孢蘑菇SRAP、ISSR、RAPD标记遗传多样性和菌群分类研究［J］. 中国食品学报, 2010, 10（6）：7-13.

［15］ 贾定洪, 王波, 郑林用, 等. 应用拮抗及ISSR方法鉴定袋料香菇菌株［J］. 西南农业学报, 2013, 26（2）：832-834.

［16］ 刘华晶. 基于不同分子标记的黑龙江省野生黑木耳遗传多样性分析［D］. 哈尔滨：东北林业大学, 2011.

［17］ 张秋胜, 徐丙莲, 刘林德, 等. 中国金顶侧耳菌株遗传多态性的ISSR分析［J］. 食品科学, 2011, 32（05）：172-175.

［18］ 崔丹. 金顶侧耳种质资源多样性的研究［D］. 吉林：吉林农业大学, 2012.

［19］ 曲绍轩, 高山, 黄晨阳. SRAP、ISSR和RAPD分子标记技术在银耳菌株鉴别上的应用［J］. 食用菌学报, 2007, 14（3）：1-5.