右美托咪定减轻失血性休克/复苏大鼠急性肾损伤*

姜远旭， 夏明珠， 黄 强， 戴中亮， 李亚丽， 张中军△

(1暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院麻醉科， 深圳市麻醉医学工程研究中心, 2深圳市罗湖医院集团湖贝社区健康服务中心， 广东 深圳 518020)

出血性休克及其复苏(hemorrhagic shock/resuscitation，HS/R)容易引起炎症反应和氧化应激反应，导致多器官损伤[1]。肾脏是失血性休克后主要受损的器官之一。研究表明，右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)具有抗炎及抗氧化作用[2-3]，并对内毒素血症及缺血再灌注诱导的肾损伤具有保护作用[2， 4]，但右美托咪定是否能通过抗炎及抗氧化作用对HS/R诱导的急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)具有保护作用尚不清楚。本研究旨在观察右美托咪定对出血性休克/复苏大鼠诱导的AKI的影响，为临床治疗出血性休克合并AKI病人提供理论依据。

材 料 和 方 法

1 药物和试剂

右美托咪定(批号12071234，江苏恒瑞医药公司)；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素1β(interleukin-1β， IL-1β)ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；抗血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)和核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)抗体(Abcam)；抗β-actin抗体(Santa Cruz)。

2 方法

2.1模型制备和分组 SPF级雄性Wistar大鼠32只,体重180～220 g，由南方医科大学实验动物中心提供，动物合格证编号为44007200047364。实验前禁食12 h，自由饮水。腹腔注射3℅戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉大鼠，股静脉置入24#套管供实验中补液和给药。颈部备皮后用碘伏消毒，分离右颈总动脉，插管作动脉压监测、放血和采集血标本。大鼠随机分为4组：(1) 生理盐水正常对照组(NS组，n=8)：股静脉注射 NS 5 mL/kg。 (2)右美托咪定组(D组，n=8): 股静脉持续输注右美托咪定5 μg·kg-1·h-1。(3) 失血性休克/复苏模型组(HS/R组，n=8)：通过颈总动脉放血(0.025 mL/kg, 超过10 min)，将血压降至40～50 mmHg，并将放出的血液保存于干燥的肝素抗凝试管中，记录放出的血液容积。维持休克状态期间若MAP超过50 mmHg，则放出部分血液，若MAP低于40 mmHg时，则回输部分失血。维持休克状态60 min后，回输采集的剩余血液及2倍的生理盐水(超过10 min)进行复苏。(4)右美托咪定治疗组(HS/R+D组，n=8): 容量复苏后60 min，股静脉持续输注DEX 5 μg·kg-1·h-1。DEX持续输注6 h后，腹腔注射3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉大鼠，麻醉后开腹，暴露下腔静脉，采集血标本，室温静置30 min，4 ℃，2 500×g离心10 min，取上清备用，随即放血处死动物，完整取出肾脏，在冰面上取部分肾脏液氮中速冻后放入-70 ℃低温冰箱保存；取部分肾脏用10%中性多聚甲醛固定24 h后，用于病理学检查。

2.2平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)的监测 颈总动脉插入套管针后，连接监护仪，稳定20 min 后，记录基础MAP，休克期间每15 min 记录 1 次MAP，复苏后每隔1 h 记录 1 次，直到实验结束。

2.3血尿素氮(blood urine nitrogen，BUN)和血清肌酐(creatinine，Cr)浓度的检测 取上述血清，血生化分析仪检测BUN和Cr的浓度。

2.4肾组织TNF-α和IL-1β含量的检测 取冰冻肾组织解冻，采用酶联免疫吸附法测定肾组织 TNF-α和IL-1β含量，严格按照说明书进行操作。

2.5肾组织MDA含量及SOD活性检测 取肾组织100 mg解冻，制备肾组织匀浆用试剂盒测定肾组织中MDA含量和SOD活性。

2.6Western blot检测肾组织HO-1和NF-κB的表达 分别取适量的肾组织，加入蛋白裂解液冰上匀浆，离心收取上清液，蛋白定量并煮沸15 min。应用10% SDS-PAGE分离后，电转移至PVDF膜上。室温下用含5%脱脂奶粉的TBS + 20% Tween 20(TBST)溶液对膜封闭1.5 h；封闭完毕后用TBST室温下脱色摇床上洗膜3次,每次10 min，洗膜后加入HO-1或NF-κB 的I抗(1∶500)，4 ℃孵育过夜；TBST室温下脱色摇床上洗膜3次，每次10 min，加入 II 抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)，室温下孵育2 h，TBST室温下脱色摇床上洗膜3次，每次10 min，最后加入化学发光增强剂，自显影。采用图像分析处理系统对蛋白条带扫描分析，根据各组蛋白吸光度与β-actin吸光度的比值表示HO-1或NF-κB 蛋白的相对表达量。

2.7肾组织病理学检查 取部分肾组织用10%中性甲醛固定24 h后,给予脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片(厚度4 μm)，苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色。Nikon Eclipse Ti-S显微镜200倍镜下观察。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0 统计软件进行数据处理和统计分析。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较行单因素方差分析(one-way ANOVA)和SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MAP的变化

与NS组相比，HS/R组在2～6 h时点的MAP降低(P<0.05)；与HS/R组比较，HS/R+D组在2～6 h时点的MAP升高(P<0.05)；而D组的变化与NS组相比差异无统计学意义，见图1。

Figure 1. The effects of dexmedetomidine (D) on MAP of rats induced by hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group.

图1右美托咪定对各组大鼠MAP的影响

2 血清Cr和BUN 浓度的变化

与NS组相比，HS/R组的BUN和Cr浓度升高(P<0.05)；与HS/R组比较， HS/R+D组的BUN和Cr浓度降低(P<0.05)；D组的变化和NS组类似，见图2、3。

3 肾组织TNF-α和IL-1β含量的变化

与NS组相比，HS/R组的TNF-α和IL-1β含量升高(P<0.05)；与HS/R组比较， HS/R+D组的TNF-α和IL-1β含量降低(P<0.05)；而D组的变化和NS组类似，见图4、5。

4 肾组织MDA含量及SOD活性的变化

与NS组比较，HS/R组的MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；与HS/R组比较，HS/R+D组的MDA含量降低，SOD活性升高(P<0.05)；而D组的变化和NS组类似，见图6、7。

Figure 2. The effects of dexmedetomidine (D) on BUN in the rats induced by hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group．

图2右美托咪定对各组大鼠BUN的影响

Figure 3. The effects of dexmedetomidine (D) on serum Cr in the rats induced by hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group.

图3右美托咪定对各组大鼠血清Cr的影响

Figure 4. The effects of dexmedetomidine (D) on TNF-α content in the kidney tissues of rats induced by hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group．

图4右美托咪定对各组大鼠肾组织TNF-α含量的影响

5 肾组织NF-κB和HO-1表达的变化

与NS组相比，HS/R组的NF-κB表达增加(P<0.05)；与HS/R组比较，HS/R+D组的NF-κB表达降低(P<0.05)；而D组的变化和NS组类似，见图8。

与NS组比较，HS/R组肾组织的HO-1表达升高(P<0.05)；与HS/R组比较，HS/R+D组肾组织的HO-1表达进一步升高(P<0.05)，而D组的变化

Figure 5. The effects of dexmedetomidine (D) on IL-1β content in the kidney tissues of rats induced by hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group．

图5右美托咪定对各组大鼠肾组织IL-1β含量的影响

Figure 6. The effects of dexmedetomidine (D) on MDA content in the kidney tissues of rats induced by hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group.

图6右美托咪定对各组大鼠肾组织MDA含量的影响

Figure 7. The effects of dexmedetomidine (D) on SOD activity in the kidney tissues of rats induced hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group.

图7右美托咪定对各组大鼠肾组织SOD活性的影响

和NS组类似，见图9。

6 肾组织病理学检查

NS组的肾组织结构基本正常；HS/R组的肾小管管腔扩张，近曲小管上皮细胞扁平，核染色边界稍不清，小管间血管充血，核泡变性，可见炎性细胞浸润；HS/L+D组的肾小管管腔稍扩张，小管上皮形态尚保存，血管充血，间质有少许炎性细胞浸润，见图10。

Figure 8. The effect of dexmedetomidine (D) on NF-κB expression in the kidney of the rats induced by hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=10.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group.

图8右美托咪定对各组大鼠肾组织NF-κB表达的影响

Figure 9. The effect of dexmedetomidine (D) on HO-1 expression in the kidney of the rats induced by hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=10.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group.

图9右美托咪定对各组大鼠肾组织HO-1表达的影响

Figure 10. HE staining of kidney tissues from each group (×200).

图10HE染色观察右美托咪定对各组大鼠肾组织病理学改变

讨 论

创伤导致的失血性休克是患者死亡的主要原因。失血性休克及其复苏容易导致重要器官缺血再灌注损伤，肾脏是其损伤的靶器官之一[5]。本实验参照以往的研究建立失血性休克及复苏模型[6]。我们的研究发现，右美托咪定可减轻肾脏炎性反应及氧化反应，改善血流动力学的变化及肾功能。病理检查结果也显示肾损伤明显减轻。我们在实验中也证实，右美托咪定可治疗明显增加HO-1的表达，抑制NF-κB的表达。以上研究表明，右美托咪定可减轻HS/R诱导的AKI， HO-1及NF-κB可能参与了这一病理生理进程。

HS/R诱导氧自由基产生，正常情况下对机体产生保护作用，如果产生过多或清除减少，那么过量产生的氧自由基将导致器官损害。一些研究表明，HS/R诱导了明显的氧化应激反应，而抗氧化治疗减轻器官损害[7]。最近的研究发现，右美托咪定通过抗氧化作用减轻不同致病因素导致的肝、肺和肾损伤[8-9]。MDA作为机体脂质过氧化作用的最终产物，它的浓度反映了组织和细胞的脂质过氧化程度；SOD能够清除过氧化产物，氧自由基等减轻组织器官的损害。我们的研究发现，DEX治疗减少HS/R诱导的肾组织MDA浓度，增加SOD活性，表明右美托咪定可通过减轻HS/R诱导的氧化反应而减轻肾损伤。HO-1是催化血红素的限速酶，广泛存在于各种细胞，也是一种抗氧化酶。最近研究表明，HO-1通过其抗炎和抗氧化作用在减轻急性肾损伤中发挥重要作用[10]。另有研究发现，上调HO-1的表达减轻HS/R诱导的肾损伤[11]。以往的研究发现，右美托咪定通过上调HO-1的表达减轻肺组织炎性反应和氧化应激反应[12]。有研究表明，HS/R本身会明显诱导肾组织HO-1的表达，是机体的一种保护反应[1, 11]。我们的研究表明，与NS组相比，HS/R诱导HO-1的表达升高，而右美托咪定治疗进一步增加HO-1的表达，提示HO-1可能参与了DEX抑制HS/R诱导的炎性反应及氧化应激反应这一病理过程。HO-1正常情况下表达很低，主要受核因子E2相关的因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2)的调控。Nrf-2是氧化应激的受体，位于各种抗氧化酶的上游，在氧化应激刺激下，Nrf-2能介导HO-1的表达，从而发挥抗氧化作用[13]。研究表明，SOD、GSH-Px和CAT等抗氧化酶的活性也受HO-1的调控，抑制HO-1的活性后，SOD、GSH-Px和CAT表达减少[ 14]，提示Nrf-2/HO-1/SOD通路可能是抗氧化的重要机制。本实验中右美托咪定的抗氧化作用是否与这一通路有关，仍须作进一步的研究。

HS/R诱导的氧化反应也导致中性粒细胞的聚集和激活，产生大量的炎性细胞因子，如TNF-α和IL-1β等。研究发现，TNF-α和IL-1β等炎性细胞因子诱发的炎性反应是导致肾损伤的重要机制之一，降低TNF-α和IL-1β的浓度可减轻HS/R诱导的器官损伤[2, 9]。在我们的研究中，HS/R组肾组织TNF-α和IL-1β明显升高，而右美托咪定治疗减轻TNF-α和IL-1β的浓度，表明右美托咪定可通过减轻HS/R诱导的炎性反应而减轻肾损伤。NF-κB是调控TNF-α在内的诸多促炎分子基因表达的重要转录因子[16]。最近研究发现，HS/R后氧化应激反应能激活NF-κB，从而在休克期间诱导大量炎性细胞因子产生[17]。研究表明，右美托咪定可通过抑制NF-κB的表达，减少炎性细胞因子的产生，从而对肾脏具有保护作用[18]。我们的研究中，右美托咪定治疗抑制HS/R诱导的NF-κB表达增加，提示右美托咪减轻HS/R诱导炎性反应可能与抑制NF-κB的表达有关。最新的研究发现，抑制HO-1的活性能增加NF-κB的表达，提示HO-1可通过抑制NF-κB的表达而发挥抗炎作用[19]。本实验中，我们并没有研究右美托咪定的抗炎作用是否与HO-1/NF-κB的表达有关。因此，须进一步做相关实验来进行论证。

本实验中，我们观察到，失血性休克复苏后，血压逐步下降，而右美托咪定治疗能够减轻血压下降的程度，提示右美托咪定对AKI的作用可能与提升MAP有关。HS/R导致缺血再灌注损伤，激活中性粒细胞释放活性氧，诱发应激反应，损害血管内皮细胞。NO是最重要的活性氮物资，NO 可与超氧化物迅速反应生成过氧亚硝基阴离子(ONOOˉ)及过(氧化)亚硝酸盐，启动脂质过氧化反应，最终损害肺泡毛细血管内皮细胞及肺泡上皮肺泡紧密连接，使其通透性增加。研究表明，NO可直接或间接抑制心脏，也可使血管张力降低，导致低血压[20]。我们的研究发现，出血性休克/复苏及随后的内毒素血症导致血液中NO增加，而DEX治疗能降低NO浓度。最近的研究发现，通过HO-1产生的一氧化碳(CO)对HS/R诱导的血管内皮有保护作用[21]。因此，右美托咪定提升血压的作用可能与抑制炎症介质，减轻氧化反应有关。

总之，右美托咪定通过抗炎及抗氧化作用减轻HS/R诱导的AKI，HO-1的表达增加及NF-κB的表达抑制可能参与了这一病理生理进程。

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