菜豆普通花叶病毒辽宁分离物的鉴定与序列分析

韩 彤，杨彩霞，付晶晶，廖一鸣，吕双玉，贾 苒，石长玉

(沈阳大学 生命科学与工程学院/辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点试验室，辽宁 沈阳 110044)

豆科(Leguminosae)菜豆属(PhaseolusL.)植物均为重要的食用作物，在我国广为栽植。但是，菜豆属植物栽培常受到植物病毒的干扰，其中最具破坏性的是菜豆普通花叶病毒(Beancommonmosaicvirus,BCMV)[1]。BCMV是一种世界性分布的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒[2]。该病毒最早由美国Stewart和Reddick在菜豆上分离到[3]，后由Pierce将其命名为BCMV[4]。BCMV的基因组是一条全长约9.6～10 kb的正义单链RNA，结构特征与典型的Potyvirus成员相同，其5′端具共价结合金属蛋白(virus genome-linked protein,VPg)，3′端具有Poly(A)尾巴[5]，中间序列编码一个长的多聚蛋白，随后切割产生8～10个产物参与病毒的复制、运动和包装。BCMV传播方式多样，主要经蚜虫非持久性传播[6-7]，还可通过机械接种、种子和花粉传毒。自然条件下可侵染多种菜豆属植物，试验条件下还能侵染藜科、茄科、苋科、豆科、番杏科等9个科、44个属的约100多种植物[8-14]。受侵染植物的病害症状主要受病毒株系、环境条件和寄主植物3个方面的影响，通常表现性状为花叶皱缩、叶片变窄或卷曲，豆荚斑驳或畸形[15]。2016年，在辽宁盖州地区发现疑似病毒侵染的菜豆样品，通过RT-PCR试验，明确了侵染菜豆的病毒为BCMV。本文首次报道了辽宁BCMV分离物的分子特征。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2015年8月，于辽宁省采集表现黄化症状的菜豆植物样品，保存于-80 ℃超低温冰箱备用(图1)。

1.2 试验方法

图1 表现黄化症状的菜豆Fig.1 The yellow symptoms showing on thePhaseolus vulgaris L. plants

1.2.1 植物总 RNA 提取 取黄化的菜豆叶片100 mg，在研钵中加入液氮后迅速研磨至粉末状，使用RNASimple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取菜豆叶片的总RNA。

1.2.2 病毒的RT-PCR检测 对菜豆病叶的总RNA进行提取后，用TIAN Script RT Kit(天根生化科技(北京)有限公司)进行cDNA第一条链的合成。以cDNA为模板，先后参照Potyvirus属通用引物Legpoty-F/Legpoty-R[16]和BCMV特异性引物BCMV-CP-F/BCMV-CP-R[17]对cDNA进行PCR扩增(引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成)。PCR反应体系为25 μL，设定PCR程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，试验进行35个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后，用10 g/L琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，将目的条带用TIANgel Midi Purification Kit(天根生化科技(北京)有限公司)回收试剂盒回收和纯化。回收产物与pMD-18T(宝生物工程(大连)有限公司)克隆载体在16 ℃下进行连接3 h后，转入DH5α菌株的感受态细胞。感受态细胞在LB液体培养基中培养1 h后，均匀的涂在固体培养基上进行过夜培养16 h。挑取单菌落，至5 mL LB液体培养基中，280 r/min，37 ℃条件下摇床培养7 h。培养结束后取2 μL菌液进行PCR鉴定。将阳性样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。

1.2.3 序列分析 测序结果及数据处理等借助DNAStar(DNASTAR Inc.，Madison，USA)和DNAMAN Version 6.0(LynnonBiosoft，Quebe Canada)软件完成。利用NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心)数据库的BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源序列搜索。采用DNAStar的Clustal V程序进行同源性分析。利用Clustal_X version 1.83[18]进行完全比对后再用软件MEGA version 5.13[19]的最大似然法绘制亲缘关系树，设置种子重复数是1 000。分支节点上的数值为后验概率，高于50%显示。用于序列比较和关系树构建的病毒序列信息见表1。

表1 BCMV 3个辽宁分离物与其它报道BCMV分离物的cp基因的氨基酸序列同源性

2 结果与分析

2.1 RT-PCR检测结果

M：Marker DL2000；1-5：Legpoty-F/Legpoty-R引物扩增结果；6-10：BCMV-CP-F/BCMV-CP-R引物扩增结果；4和9是健康植物样品；5和10是水为对照M：Marker DL2000；lanes 1-5 are results amplified with Legpoty-F/Legpoty-R；lanes 6-10 are results amplified with BCMV-CP-F/BCMV-CP-R;4 and 9 are healthy plants control;5 and 10 are water control图2 菜豆病叶的BCMV病毒RT-PCR检测结果Fig.2 Detection of BCMV virus in Phaseolus vulgaris L.diseased leaves by RT-PCR

利用Legpoty-F/Legpoty-R引物[16]对菜豆病叶的cDNA进行扩增得到约725 bp的目的片段，而健康菜豆中没有检测到该片段。Blast检测显示该片段与BCMV高度同源。于是，利用已报道的BCMV特异性引物BCMV-CP-F/BCMV-CP-R引物[17]继续扩增，获得长约1.2 kb的片段，包含了完整的外壳蛋白基因(coat protein,cp)(图2)。

2.2 序列分析

盖州的3个菜豆样品上BCMV分离物CP基因均为861 bp(GenBank登录号是MF361092-MF361094)，编码287个氨基酸，氨基酸同源性为100%。3个分离物与已经报道的BCMV的同源性分析显示，它们均与BCMV的美国艾奥瓦州菜豆分离物BCMV-[USA:Iowa:Phaseolus vulgaris](KM023744)同源性最高，为97.9%，其次是与印度菜豆分离物BCMV-[India:Phaseolus vulgaris](KF114860)同源性为97.6%，与英国菜豆分离物BCMV-[EN:Phaseolus vulgaris](AY112735)同源性为96.9%，与澳大利亚分离物BCMV-[AUS:Macroptiliumatropurpureum](EU761198)同源性为96.5%。与中国分离物同源性在91.3%～95.8%，其中最高的是BCMV-[CN:soybean](KC832501)95.8%，其次是BCMV-[CN:ZJ:cowpea](NC_003397)、BCMV-[CN:mung bean](KC832502)和BCMV-[CN:ZJ:cowpea](AJ312437)，均为94.8%(表1)。系统进化树分析显示，BCMV没有明显的聚类限制，它们主要聚类在两个分支上，盖州3个分离物与BCMV-[CN:mung bean](KC832502)、BCMV-[AUS:Macroptiliumatropurpureum](EU761198)、BCMV-[India:Phaseolus vulgaris] 和BCMV-[USA:Iowa:Phaseolus vulgaris](KM023744)聚集在一个分支上，而其他中国分离物与韩国分离物聚集在另一个分支上。

图3 基于已报道的BCMV cp基因核苷酸序列构建的系统树Fig.3 Phylogenetic trees based on cp sequences of the previously reported BCMV

3 结论与讨论

本研究在辽宁盖州地区的菜豆上分离鉴定到BCMV病毒，通过RT-PCR检测、克隆和测序，获得完整的cp基因。基于cp基因的同源性比较，发现3个分离物与BCMV的美国艾奥瓦州菜豆分离物BCMV-[USA:Iowa:Phaseolusvulgaris](KM023744)同源性最高，为97.9%。根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)第9次报告中的马铃薯Y病毒的分类标准，cp基因氨基酸序列相似性小于80%，或者核苷酸序列相似性小于76%，可认为是不同病毒种[5]。因此，侵染菜豆病毒是BCMV的辽宁分离物，这是辽宁首次报道菜豆上自然存在BCMV病毒。

BCMV是众多能自然侵染豆科植物病毒中危害性最强的，BCMV具有寄主范围广泛、传毒效率较高、传播方式多样等特点，极易造成豆科植物特别是菜豆的减产甚至绝收，对农业生产造成极大的危害。近年来，BCMV先后从中国的浙江、台湾、山东、南京、湖北的豇豆、绿豆、黑眼豇豆、扁豆、花生和芝麻[20-24]上分离出来，但在辽宁未见BCMV相关报道。菜豆等豆科作物在辽宁普遍种植，这些作物是否也受到BCMV的侵染和危害? 本研究经过试验确定辽宁菜豆黄化病害相关病毒是BCMV。后续将加大对辽宁地区BCMV病害调查范围，提供更多BCMV辽宁分离物序列信息，为BCMV的防治提供重要的理论依据。

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