虎杖苷对急性百草枯中毒大鼠肺损伤的干预研究

张新彧，黄 杨，孙纪元，徐云云

百草枯对人畜均有很强的毒性，因误服或自服引起急性中毒屡有发生，已成为农药中毒致死事件的常见病因[1-2]。由于至今尚无有效解毒药物[3]，许多治疗方法虽取得了一些临床效果，但中毒死亡率仍较高[4-5]，且绝大多数存活患者存在肺间质纤维化而预后不良[6]。研究已发现，百草枯经由能量依赖性多胺摄取进入肺内聚集，形成氧化还原循环,产生大量的活性氧(ROS)，从而诱导脂质过氧化，打破了自身氧化物及抗氧化物的平衡状态；另一方面，各类炎性细胞的积聚,诱发肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等炎性因子大量分泌，使肺内炎性反应失控，最终导致肺组织脂质过氧化加剧，炎性细胞浸润，肺泡上皮细胞凋亡[7-8]，这些是促使百草枯中毒急性肺损伤(ALI)形成的主要因素。有研究发现，虎杖苷可以清除O2-及-OH，并对DPPH自由基、脂质过氧化物都有抑制作用，且有浓度依赖性[9]。本实验用虎杖苷对急性百草枯中毒大鼠进行治疗，寻找切实有效的能缓解百草枯氧化损伤及抑制炎性因子释放的理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1实验动物、药品及主要试剂 选用清洁级健康成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重(250±20)g，由空军军医大学动物实验中心提供，许可证号:SCXK(陕)2014-002,符合国家健康一级动物标准。药品及试剂为20%百草枯、虎杖苷、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)均由南京建成生物工程研究所提供。TNF-α、IL-6由武汉伊艾博科技有限公司提供。

1.2动物分组及模型制作 SD雌性大鼠60只，随机分为正常对照组、染毒组和虎杖苷干预组，每组20只。根据预实验结果，染毒组和虎杖苷干预组大鼠均以20%百草枯水剂按25 mg/kg一次性灌胃，建立百草枯中毒模型。虎杖苷干预组在染毒后60 min给予虎杖苷120 mg/kg灌胃，染毒组及正常对照组给予等量1 ml/kg生理盐水灌胃，每日1次，共3 d。3组大鼠均按照原设计的时间点(6、24、48、72 h，每次5只)处死，分别收集血清和肺组织标本。

1.3观察指标和方法 在不同时间点处死相应大鼠，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，经腹主动脉采血5～8 ml，4℃冰箱放置2 h，3000 r/min，离心10 min，取上清，分装保存，于-80℃冰箱保存；采用生化法检测血清中MDA、SOD活性和MPO水平，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中TNF-α和IL-6水平；采血完毕后，每组大鼠同时取出右肺上叶拭干表面血液，精确称量湿肺重量，再置于60℃烘箱中干燥48 h至重量恒定后，取出再次称量计算肺干重，确定肺湿干比=肺湿重/肺干重。

2 结果

2.1肺组织湿干比 染毒组和虎杖苷干预组肺湿干比重随着中毒时间延长而逐渐升高，在中毒24、48、72 h时高于正常对照组(P<0.01)。虎杖苷干预组24、48、72 h肺湿干比明显低于染毒组(P<0.01)。见表1。

表1 3组大鼠不同时间点肺湿干比比较

注:与正常对照组比较,bP<0.01;与染毒组比较,dP<0.01

2.2血清中MDA、SOD和MPO水平 染毒组和虎杖苷干预组血清MDA、MPO水平在6、24、48、72 h高于正常对照组，血清SOD水平均低于正常对照组(P<0.01)。与染毒组比较，虎杖苷干预组血清MDA、MPO水平在6、24、48、72 h均明显降低,血清SOD水平明显增高(P<0.01)。见表2。

表2 3组不同时间点血清MDA、SOD和MPO水平比较

注:MDA为丙二醛，SOD为超氧化物歧化酶，MPO为髓过氧化物酶；与正常对照组比较，bP<0.01;与染毒组比较，dP<0.01

2.3血清中TNF-α和IL-6水平 染毒组和虎杖苷干预组血清中TNF-α和IL-6水平6、24、48、72 h高于正常对照组(P<0.01)；与染毒组比较，虎杖苷干预组6、24、48、72 h血清中TNF-α和IL-6水平降低(P<0.01)。见表3。

表3 3组不同时间点血清中TNF-α和IL-6水平比较

注:TNF-α为肿瘤坏死因子-α，IL-6为白介素-6；与正常对照组比较，bP<0.01;与染毒组比较,dP<0.01

3 讨论

多数学者认为，百草枯主要通过肺泡Ⅱ型细胞主动转运入肺内,使肺脏成为百草枯中毒的主要靶器官[10]，从而引起ALI和急性呼吸窘迫综合征，最终使患者呼吸衰竭是百草枯中毒致死的主要原因[11]。研究发现，百草枯一旦进入人体后，可以逆浓度梯度差主动重吸收到肺，并通过NADH依赖反应形成氧化还原循环，首先导致各种有毒高活性氧自由基(H2O2、O2-、-OH)激增,诱导过度脂质过氧化反应，生成过氧化产物MDA等，造成细胞膜和线粒体等部位产生损伤，其次,导致SOD及其他还原酶活性的降低和NADH等还原当量的耗尽[10]，因而引发抗氧化防御能力失衡；另一方面，肺组织开始出现如中性粒细胞等各类炎性细胞积聚，使肺内炎性反应失控，最终影响了生物氧化磷酸化，能量合成减少至停止，引起细胞衰竭，使依赖核苷酸生化反应的肺表面活性物质无法产生[12]，加速百草枯中毒的肺损伤。

自身氧化物及抗氧化物的平衡状态标志着正常的氧化应激水平。多项百草枯中毒实验研究结果表明，MDA是多不饱和脂肪酸发生过氧化产生的脂质过氧化物之一,是反映体内氧自由基的代谢状况及组织受自由基攻击程度可靠指标[13],其水平大幅升高，可以间接反映百草枯中毒肺损伤的程度[14]；SOD是机体二级抗氧化酶系统的标志物，具有清除自由基、抗脂质过氧化的作用，其活性下降反映机体抗氧化防御能力的降低[15]；MPO主要存在于多形核白细胞的嗜天青颗粒中，其活力是反映机体内中性粒细胞活化、浸润的可靠指标,升高可启动脂质过氧化，能够较好反映致百草枯中毒早期肺部炎症的发生、发展进程[16]。本研究结果显示，与正常对照组比较，染毒组血清中MDA、MPO水平显著升高，SOD水平显著降低。提示百草枯中毒后早期氧自由基的清除能力下降，提示染毒动物模型氧化应激反应较明显，产生氧自由基而引发脂质过氧化，使生物膜进一步受到MDA攻击，抗氧化防御能力降低，使得氧化(MDA)-抗氧化(SOD)失衡，符合实验预期。现代药理学相关研究表明，虎杖苷在抗脂质过氧化、抗炎免疫、抗肺损伤等方面的药理作用被证实[9,17]。另有研究报道，虎杖苷能够明显抑制炎性细胞因子的分泌，在体内和体外发挥显著的抗氧化能力[18]。本研究结果显示，与染毒组比较，虎杖苷干预组血清中MDA、MPO水平均明显降低，而SOD水平明显增高，提示虎杖苷对百草枯中毒后肺损伤的氧化应激反应过程有一定的调节作用，可减少体内ROS的生成，并可减少各种炎性介质的产生，能有效延缓肺损伤的改变。

近年来,在ALI机制中,多种类型细胞及细胞因子在介导炎症肺组织损伤过程中所起的作用日益受到重视并成为研究的热点。王鑫等[19]研究证实了百草枯可介导单核细胞产生大量的白介素和TNF-α与肺组织的炎症水平密切相关。相关研究证实，TNF-α是体内细胞因子调节网络的启动因子，其水平的增高，具有触发进一步炎性反应的作用,被称之为早期炎性反应细胞因子。IL-6具有广泛的生物学功能，在炎症阶段通过调节辅助淋巴细胞的活性,趋化粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞的积聚,介导炎性反应，从而又导致IL-6水平的升高[20-22]。在实验中，染毒组血清中TNF-α和IL-6水平均高于正常对照组，这是造成肺通透性增高，使肺水肿及透明膜形成，是肺湿干比升高的直接原因，最终导致肺内炎性反应失控，与ALI的发生关系极为密切[23-24]。本研究结果显示，虎杖苷干预组肺湿干比、血清中TNF-α、IL-6水平均明显下降，再次证实了虎杖苷可在百草枯中毒致ALI中发挥抗炎、减轻水肿的作用。

综上所述，氧化应激反应与炎性因子均参与了百草枯中毒急性肺损伤的过程，虎杖苷干预后抑制了氧化应激反应，使得炎性因子的水平降低，这种作用可能与MDA、SOD、MPO和TNF-α、IL-6有关，因而，虎杖苷对百草枯中毒导致的肺损伤有一定的治疗效果，值得进一步系统深入研究。

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