供氮水平和稳定性对苹果矮化砧M9T337幼苗生长及 15N吸收、利用的影响

彭 玲，田 歌，于 波，何 流，葛顺峰，姜远茂

（山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018）

氮素是果树必需矿质元素中的核心元素，对果实产量形成和品质提高具有重要作用[1]。氮素示踪研究表明，早春苹果根系从土壤中摄取的氮素极少，从花期到采收前这段时期则是当年施氮肥发挥效用的有效期。目前我国苹果生产上氮肥施用标准不明确，多采用早春一次性大量施氮或关键物候期大量追氮方式。早春大量施氮前期根层氮素浓度高，随时间延长后期易出现氮肥供应不足。而花期至采收前恰逢夏季多雨期，氮肥淋失风险大，此期再大量追氮易造成根层氮素浓度的剧烈变化。这些施氮方式下氮素利用率低、树体贮藏营养不足，导致产量不稳、果品质量下降[2–3]。近年来，总量控制分期调控、缓控释氮肥及水肥一体化等技术逐渐在果园中得到应用，通过调控根层氮素浓度，直接或间接实现了氮素养分的稳定供应，有效减少了氮素损失，提高了氮素利用率[4–5]，但这种养分稳定供应方式对果树生长及养分吸收具体的效用机理缺乏深层次的分析。

近年来，关于根层氮素浓度与植株生长发育的关系引起了科研人员的重点关注。局部供应低浓度NO3

–刺激拟南芥侧根生长，高浓度抑制侧根发育[6]。与高氮相比，低胁迫下油菜幼苗氮素和干物质累积量显著下降，但氮素利用效率显著升高[7]。苹果是喜硝植物，不仅对苹果的生长起营养作用，还可作为信号物质调控苹果的代谢与发育过程。苹果吸收NO3–后，绝大部分需要在叶片中同化，硝酸盐在硝酸还原酶 (nitrate reductase, NR) 和亚硝酸还原酶 (nitrite reductase, NiR) 的共同作用下转变为铵，合成氨基酸和核苷酸等成分，并进一步影响植物碳素代谢过程。NR是氮素同化过程中控制反应重要的限速酶，在NR缺失突变体的烟草中发现，植株NR活性低，地上部积累导致地上部及根系的相对生长速率均受到影响[8]，说明植物生长不仅受外源水平的影响，还受自身氮素营养状况的调节，其中NR活性的变化起着决定性的调节作用[9]。因此，研究苹果植株氮素吸收、体内含量及NR活性的关系，对阐明不同供氮浓度对苹果生长的生理机制具有重要意义。

高产、稳产和优质是苹果栽培管理的核心，而根层氮素供应浓度的高低及稳定程度是造成低产和高产苹果园产量差异的关键因素[10]，因此保证苹果关键物候期根层氮素供应稳定、充足而不过量既是保障高产苹果氮素需求的关键，又是降低氮素向环境损失的核心。目前，在苹果上关于施氮效应的评价体系不够健全，以往的研究多以产量和品质为评价指标集中在不同施氮期[11–12]及施氮量[2–3]对苹果氮素利用率、产量、品质及土壤质量[13]、环境污染[14]等方面，而关于根层氮素浓度及稳定程度对苹果根系及地上部生长发育的研究较少，苹果植株在不同供应条件下响应的生理机制尚不明确。因此，本试验以M9T337矮化自根砧苹果幼苗为试材，采用15N同位素示踪及非损伤微测技术，并设置不同氮素浓度变换方式，分析比较了苹果幼苗在不同氮素供应水平及氮素稳定与非稳定供应方式下根系形态、地上部生长及氮素吸收利用的生理差异，旨在明确苹果植株在不同氮素供应条件下响应的生理机制，从而丰富苹果氮素需求理论，并为果树生产上氮素适量稳定供应方式的效用机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

供试苹果试材为M9T337矮化自根砧幼苗。将长至6片真叶左右的幼苗定植于泡沫板上，每板15孔，每孔定植1株，每盆加入营养液2 L。先用1/2浓度Hoagland营养液培养7 d，然后转入全浓度Hoagland营养液，每隔2 d换一次营养液，每日定时通气。待幼苗长至 10片真叶左右时，选取生长一致的幼苗用蒸馏水进行饥饿处理7 d，以消耗幼苗中积累的硝态氮。

正式试验后采用全硝态氮[Ca(15NO3)2，上海化工研究院生产，丰度为10.16%]为唯一氮源。根据预试验设计的硝态氮浓度 (0、2.5、5、10和20 mmol/L)处理后，5 mmol/L硝态氮处理下苹果幼苗长势最好，因此适宜供氮浓度设为5 mmol/L。设置5个供氮方式：1) 先用0.5 mmol/L培养 10 d，然后更换为25 mmol/L再培养 10 d (即，浓度由低变高处理，N1)；2) 先用25 mmol/L NO3–培养 10 d，然后更换为0.5 mmol/L再培养 10 d (即，浓度由高变低处理，N2)；3)5 mmol/L持续培养20 d (即，适宜稳定供氮处理，N3)；4) 0.5 mmol/L持续培养20 d (即，持续低氮处理，N4)；5) 25 mmol/L持续培养20 d (即，持续高氮处理，N5)。在低浓度硝酸盐处理中，用CaCl2将Ca2+补充到和5 mmol/L处理相同的钙水平[15]。每个处理6次重复，每个处理各90株幼苗。每隔2 d换一次营养液，试验所用溶液均用蒸馏水配制，用H3PO4或NaOH将营养液pH调至6.0 ± 0.1，每个处理均加硝化抑制剂双氰胺。人工气候室培养条件为14 h光照 (22℃)，10 h黑暗 (18℃)，相对湿度约75%，冠层光强 600 μmol/(m2·s)。

分别于处理后第11 d (变换浓度后第1 d) 和第20 d (变换浓度后第10 d) 分析各处理15N吸收、利用状况，根系形态指标、根系吸收流量及根系和叶片硝态氮含量，每隔4 d测定幼苗根系和叶片硝酸还原酶 (NR) 活性。

1.2 样品采集与测定

1.2.1 植株解析样品测定 将苹果幼苗解析成根、茎、叶三部分，放入牛皮纸信封105℃杀青30 min，80℃烘干至恒重，用万分之一电子天平称量各器官的干物质量，并计算根冠比。随后用不锈钢电磨粉碎，过0.25 mm筛后测定各器官15N丰度和器官全氮量。全氮用凯氏定氮法测定，15N丰度在中国农业科学院原子能利用研究所用MAT-251质谱仪 (美国菲尼根公司) 测定。

1.2.2 根系形态指标测定 根系经清水冲洗后用透射扫描仪 (ESPON Perfection V750) 对根系样品进行扫描，获取单株幼苗根系图像，再利用WinRHIZO(Regent Instruments Inu.，加拿大) 根系分析软件进行根系长度、根系表面积、根尖数分析。

1.2.3 硝酸还原酶 (NR) 活性及硝态氮含量测定 根系和叶片硝酸还原酶 (NR) 活性参照李合生[16]的方法测定，硝态氮含量采用任同辉[17]的水杨酸比色法。

测试完成后数据分析采用旭月公研发的数据分析软件Mageflux进行，将结果代入Fick第一扩散定律公式J = –D (dc/dx) 制作的流速换算表 (Jcal V3.3)，流速值J正值为外流，负值为内流。

1.3 数据处理

主要计算公式：

Ndff (%) = [植物样品中15N丰度 (%) – 自然丰度(%)]/[肥料中15N 丰度 (%) – 自然丰度 (%)] × 100；器官全氮量 (g) = 器官生物量 (g) × 氮含量 (%)；器官15N 吸收量 (g) = Ndff × 器官全氮量 (g)。

采用Excel 2003对数据进行统计分析，采用DPS7.05数据处理系统进行单因素方差分析，多重比较采用LSD法。利用Excel 2003软件作图，图表中数据为平均值 ± 标准差。

2 结果与分析

2.1 供氮浓度变化对苹果矮化砧M9T337幼苗生长的影响

表1表明，不同处理11 d后 (即NO3–浓度变换1 d后)，苹果幼苗地上部干重以N3处理最高，其次为N5处理，两处理间差异不显著。N1和N4处理地上部干重显著低于其他处理。N1、N2、N4和N5处理根系干重分别比N3处理低11.4%、19.5%、6.5%和25.6%，幼苗根冠比随供氮浓度的增加显著降低，差异达显著水平。不同处理20 d后 (即NO3–浓度变换10 d后)，苹果幼苗地上部干重为N3 ＞ N5＞ N1 ＞ N2 ＞ N4。与 N3 处理相比，N1、N2、N4 及N5处理根系干重分别降低了28.6%、18.9%、12.5%和46.5%。幼苗根冠比以N4处理最大，其次为N2处理，最小的为N5处理。

随处理时间的延长，各处理生物量的变化不仅体现在总量上，也表现在其增量的比例上。两次取样间隔内，N1、N2、N3、N4和N5处理苹果幼苗地上部生物量的增幅分别为38.8%、8.5%、29.8%、9.4%和19.6%，而根系生物量增幅则以N2处理最大，N5处理最小。幼苗根冠比也表现为N4处理下越大，N5处理下越低的趋势，说明增加NO3–浓度促进苹果幼苗地上部生长，降低根系生物量。

2.2 供氮浓度变化对苹果矮化砧M9T337幼苗根系形态的影响

在影响植株对硝酸盐吸收能力方面，根系形态特征对氮素的获取起重要作用。不同NO3–供应条件对苹果幼苗根系生长影响的差异较大 (表2)。整个处理期间，均以N3处理根系长度、总表面积最大，根尖数最多，其次为N4处理，最小的为N5处理。浓度变换1 d后，N1处理根系长度和总表面积与N4处理差异不显著，但均显著高于N2处理。随处理时间的延长，浓度变换对苹果幼苗根系生长的影响加大。浓度变换10 d后，N1处理根系长度、总表面积及根尖数均小于N4和N2处理，且与N4处理间差异达显著水平。与浓度变换 1 d 时相比，N2处理的根系长度、总表面积及根尖数增幅最大，分别为31.5%、34.9%和42.0%，增幅最小的为N5处理，分别为8.9%、12.6%和14.0%。说明苹果幼苗根系通过感受外界浓度变化做出反应，低氮下促进根系生长，而高氮处理时间越长越不利于其根系的生长。

表 1 不同供氮水平和稳定性下苹果矮化砧M9T337幼苗地上部干重、根系干重及根冠比Table 1 The dry weight of shoot and root and root/shoot ratio of M9T337 dwarf rootstocks seedlings under different nitrogen concentrations and stabilities

表 2 不同供氮水平和稳定性下苹果幼苗根系长度、根系总表面积及根尖数Table 2 The root length, root surface area and tip quantity of M9T337 dwarf rootstocks seedlings under different nitrogen concentrations and stabilities

2.3 供氮浓度变化对苹果矮化砧M9T337幼苗氮素吸收、利用的影响

2.3.1 供氮浓度变化对苹果矮化砧M9T337幼苗总氮量、15N吸收量的影响 由表3可知，不同处理11 d后 (即浓度变换1 d后)，随外界浓度的增加，苹果幼苗总氮量和15N吸收量增加，在N3处理下累积到最大值，分别为66.74 mg和8.61 mg。N5处理下幼苗总氮量和N3处理间差异不显著，而15N吸收量显著小于N3处理，表明过量施氮下幼苗氮素吸收量并非与施氮量成正比增加。与N4处理相比，N1处理幼苗总氮量及15N吸收量分别增加了8.2%和16.8%。N2与N5处理相比，幼苗总氮量差异不显著，15N吸收量降低了5.0%，但两者总氮量和15N吸收量均显著高于N1和N4处理。

表 3 不同供氮水平和稳定性下苹果幼苗总氮量及15N吸收量Table 3 The total N content and 15N absorption of M9T337 dwarf rootstocks seedlings under different nitrogen concentrations and stabilities

2.3.2 供氮浓度变化对苹果矮化砧M9T337幼苗各器官Ndff的影响 Ndff是指植株器官从肥料15N中吸收分配到的15N量对该器官全氮量的贡献率，它反映了植株器官对肥料15N的吸收征调能力。表4表明，NO3

–浓度变换1 d后，N3处理下苹果幼苗各器官Ndff值最高，其次为N5处理，最低的为N4处理，N3和N5处理间叶片Ndff值差异不显著。与N4处理相比，N1处理根系和茎部Ndff值分别增加12.76%和9.5%，叶片Ndff值无显著差异。N2处理根系Ndff值比N5处理降低了5.3%，茎部和叶片Ndff值差异不显著。表明大幅度变换浓度1 d主要影响苹果幼苗根系的氮素吸收征调能力，而对茎部和叶片的影响较小。

表 4 不同供氮水平和稳定性下苹果幼苗各器官Ndff (%)Table 4 The Ndff values in different organs of M9T337 dwarf rootstocks seedlings under different nitrogen concentrations and stabilities

2.4 供氮浓度变化对苹果矮化砧M9T337幼苗根部NO3–流量的影响

2.5 供氮浓度变化对苹果矮化砧M9T337幼苗根系及叶片硝态氮含量的影响

图2表明，不同处理第11 d (即NO3–浓度变换1 d后) 苹果幼苗根系和叶片硝态氮含量在N5处理下达到最大值，分别为460.92 μg/g FW和325.70 μg/g FW，其次为N3处理，两处理间无显著差异，最小的为N4处理。说明增施硝态氮肥可提高苹果体内硝态氮含量，但其含量不同硝态氮施用量成比例增加。与N4处理相比，N1处理幼苗根系和叶片硝态氮含量分别增加了15.4%和8.2%。N2处理幼苗根系硝态氮含量比N5处理降低了9.6%，而叶片硝态氮含量无显著差异。可见，提高浓度 1 d 后苹果幼苗根系和叶片硝态氮含量均会增加，而降低浓度1 d后对叶片硝态氮含量影响较小。

图 1 不同供氮水平和稳定性下苹果矮化砧M9T337幼苗根部NO3–流量Fig. 1 The NO3– uptake flux in roots of M9T337 dwarfrootstocks seedlings under different nitrogenconcentrations and stabilities

图 2 NO3–-N浓度变化1 d 及10 d 后苹果矮化砧M9T337幼苗根系及叶片硝态氮含量Fig. 2 NO3– contents in the roots and leaves at 1 day and 10 days after changing NO3–-N concentration for M9T337 dwarf rootstocks seedlings

2.6 供氮浓度变化对苹果矮化砧M9T337幼苗硝酸还原酶 (NR) 活性的影响

苹果幼苗经硝酸盐饥饿处理后体内硝态氮含量较低，转移到全硝态氮营养液后迅速吸收硝态氮，从而诱导NR活性的提高。由图3可知，N4处理根系NR活性一直显著低于其他处理，且在处理期间变化幅度最小。各处理根系NR活性在第4 d时快速上升，并在第8 d时均达到最大值，其大小为N5 ＞N2 ＞ N3 ＞ N4 ＞ N1。浓度变换后对幼苗根系NR活性影响较大，处理12 d后，N1处理根系NR活性显著增大，N2处理根系NR活性则显著降低，至处理第16 d时，根系NR活性大小为N1 ＞ N5 ＞N3 ＞ N2 ＞ N4，N3和N5间差异不显著，其他处理间差异显著。处理第20 d时除N1处理外，其他处理间无显著差异。综上表明，苹果幼苗根系NR活性受生长介质中浓度的制约，一定处理时间内，浓度与其NR活性呈正相关。各处理叶片NR活性与根系变化趋势不同，不同水平对叶片NR活性的影响因处理时间长短而异。不同水平处理4 d后，各处理叶片NR 活性上升到最大值，大小为 N5 ＞ N2 ＞ N3 ＞ N4 ＞N1，随后各处理叶片NR活性逐渐下降，至处理第8 d时各处理间无显著差异。处理12 d后，N2处理叶片NR活性一直降低，其他处理叶片NR活性则又逐渐上升，至处理第16 d时，N1和N3处理叶片NR活性显著高于其他处理，且两者之间无显著差异。随后各处理叶片NR活性均逐渐降低，至处理第20 d时，各处理叶片NR活性大小顺序为N3 ＞ N1 ＞N5 ＞ N2 ＞ N4。可见随处理时间的延长，适宜稳定供氮处理越有利于叶片NR活性的提高。

图 3 不同供氮水平和稳定性下苹果矮化砧M9T337幼苗根系及叶片硝酸还原酶活性Fig. 3 Nitrate reductase activities in root and leaves of M9T337 dwarf rootstocks seedlings under different nitrogen concentrations and stabilities

3 讨论

3.1 供氮浓度变化对苹果矮化砧M9T337幼苗生长及根系构型的影响

已有研究表明，施氮可以促进植物的生长，且对地上部生长的促进作用优于根系[20]。本研究高氮处理下苹果幼苗地上部生物量显著高于低氮处理，NO3–浓度由低变高后地上部干物质积累量的大幅增加更体现出与前人研究结果的一致性。但苹果幼苗生物量并未随施氮量的增加呈正比增加，至处理结束时，持续高氮及浓度由低变高处理地上部干重显著低于适宜稳定供氮处理。在玉米幼苗上也发现，超过一定浓度后，地上部生物量不受水平的影响[15]，与生产上过多施用氮肥作物产量反而降低及“报酬递减率”现象结果相似。低氮处理下由于供氮不足导致植物体内蛋白质合成量降低，细胞分裂减慢，造成地上部生长受阻[21–22]，浓度由高变低后幼苗地上部干重增幅最小进一步体现出低氮对植物生长的抑制作用。

植物遇到养分供应强度的改变首先会调节根系的生长及生理学反应，根系形态的适应性变化无疑是最重要的[23]。根据Ingestad等[24]的植物稳态矿质营养理论，养分适量稳定供应下可实现植物最适生长。适宜稳定供氮处理下苹果幼苗地上部生物量最大，同时根系各形态指标也显著高于其他处理，充分挖掘了苹果幼苗的生长潜力。持续低氮处理根长、根系总表面积及根尖数显著高于高氮处理，浓度由高变低后苹果幼苗根系生长增幅也最为明显，说明供氮不足情况下植物会通过促进根系的生长，来提高对养分的吸收。低氮处理下苹果幼苗地上部干重明显下降，而根系干重的相对增加导致根冠比增大，这与孙虎威等[21]在水稻、郭芸珲等[25]在菊花上的研究结果一致。

3.2 供氮浓度变化对苹果矮化砧M9T337幼苗氮素吸收、利用的影响

同一物种，pH等条件一致情况下，外源氮浓度是影响氮吸收的主要因素之一[29]，但吸收速率也受植物体内氮状况的调节。向氮饥饿的大麦幼苗中供应，根中流入速度迅速增加，十几小时后达到高峰，随着根中浓度的增加，的流入速率下降，推测认为植株的氮营养状况对的吸收起负反馈调节作用[30]。本试验中浓度由低变高24 h后苹果幼苗根毛密集区吸收速率最高，而浓度增加10 d后与24 h时相比，其吸收速率降低了62.0%，降幅最大，持续高氮处理20 d后流量变为外排。Lainé等发现吸收速率受植株内部含氮化合物浓度的影响，与地上部浓度呈负相关[31]。试验期间持续高氮处理下叶片硝态氮含量始终最大，浓度由低变高10 d后其叶片硝态氮含量增幅也最高，这可能是导致高氮处理时间越长，根系吸收速率下降越快的原因之一，植株体内浓度的增加逐渐对吸收产生了负反馈调节作用。

在杨树上发现，将高氮处理下幼苗转移到低氮培养基中24 h后，根系流速由外排转为吸收[32]。本试验浓度由高变低后根系吸收速率也显著高于持续高氮处理，且随处理时间的延长，其吸收速率有所提高，这可能是植物在感受外界低浓度后通过促进根系生长，提高根系吸收速率来促进氮素吸收的一种响应机制。但供氮不足始终限制了幼苗对氮素的吸收，从而导致持续低氮处理下幼苗总氮量及15N吸收量最小，浓度由高变低后幼苗总氮量及15N吸收量的增幅也显著小于其他处理，不利于苹果幼苗氮素营养。处理期间适宜稳定供氮处理苹果根系吸收速率一直保持在较高水平，同时各器官Ndff值最大，从而提高了对氮素吸收征调能力，因而其总氮量及15N吸收量最高。

4 结论

随时间延长，供氮不足限制幼苗氮素吸收，主要抑制地上部生长。供氮过量导致硝态氮在叶片累积，氮素同化及根系生长受抑。适宜稳定供氮处理通过保持较高的吸收速率和Ndff值，促进根系对氮素吸收。同时逐渐提高叶片NR活性，促进体内硝态氮同化，达到对氮素的高效吸收利用，从而实现苹果幼苗最适生长。

参 考 文 献：

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