树干注药对马尾松针叶几种生理指标和保护酶活性的影响

杨鼎超，郝菲菲，张 扬，张林平，栾丰刚，曾菊平

（江西农业大学 林学院， 江西 南昌 330045）

树干注药技术是将药剂直接注入树干内[1]，药剂在树体内具有较长的残留期，相对于喷雾法和烟雾法，其对林木蛀干、枝梢等害虫有良好的防治效果，且不易污染环境、杀伤天敌等，因此，树干注药技术在林木害虫防治中得到极大应用[2-4]。唐光辉等研究表明有内吸性的药剂在树体内的活性不如无内吸作用的药剂[5]。这表明注干药剂不等同于内吸性药剂，药剂的防效取决于助剂类型。然而，药剂在树体内与植物密切接触，会对植物产生直接的影响[6]，故对树干注药开展安全性研究具有重要意义。

氯氟氰虫酰胺是浙江省化工研究院有限公司自主开发的一类高效、作用机制独特的邻苯二甲酰胺类新型杀虫剂[7]，与传统的杀虫剂无交互抗性，对哺乳动物较为安全，已广泛用于鳞翅目害虫的防治[8-11]。目前，国内外有关氯氟氰虫酰胺在林木中输导及其安全性评价的研究尚未见报道，而氯氟氰虫酰胺在林间对松材线虫病Bursaphelenchus xylophilus表现出良好的防效[12]。为此，采用树干注药技术将氯氟氰虫酰胺液体制剂注入马尾松Pinus massoniana树干内，分析其对马尾松针叶叶绿素含量、可溶性糖含量、丙二醛、苯丙氨酸解氨酶和超氧化物歧化酶的影响，探索其对马尾松生理代谢的作用机制，为树干注药技术对马尾松的安全性评价和松材线虫病防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

4.8 %氯氟氰虫酰胺乳油，4.5%甲维盐乳油由江西大农化工有限公司提供，分别装至50 mL容量注射瓶内。丙酮、丙二醛试剂盒、超氧岐化酶试剂盒、苯丙氨酸解氨酶试剂盒、蒽酮、乙酸乙酯等药剂和试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。

供试树木马尾松，于江西农业大学南昌商学院校园内选择树龄8 a，树高5 ～ 6 m，胸径8 cm左右，生长良好的马尾松45棵。

1.2 树干注药及采样

于2015年3月25日采用注干施药技术，用便携式电钻倾斜45°在马尾松树干距地面1.3 m处打1个4 ～ 5 cm深的孔，每棵树分别注入4.8%氯氟氰虫酰胺乳油或4.5%甲维盐乳油1瓶（50 mL），每个处理重复3次（每个重复5株，即2种药剂各注15棵），以不注药的等量马尾松为对照（CK）。在注药后的1 d，4 d，8 d，12 d，16 d分别在处理树冠中部的东、西、南、北四个方向进行针叶取样，每个方向每次取样量不少于30 g，将针叶用自来水冲洗干净擦干后，密封于真空封口袋中，置于-20℃冰箱中保存备用。

1.3 生理指标测定

将待测的马尾松针叶于105℃下杀青，80℃下烘干，称重后研磨粉碎。叶绿素含量的测定采用丙酮法进行，具体方法参考张宪政[13]，并略有改动。可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法进行，具体方法参考李合生等[14]，并略有改动；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定[15]。

1.4 保护酶活性测定

酶粗提液的制备具体方法参照唐光辉等[16]，并稍作改动。苯丙氨酸解氨酶（PAL）通过测定D290值，以D290变化0.01为1个酶活力单位[17]；超氧化物歧化酶（SOD）采用黄氮蓝四唑法（NBT）测定[14]，每分钟内抑制光氧化还原NBT 50%为1个酶活性单位（U），酶活性为每克鲜样的U数（U·g-1）。

1.5 数据分析

试验数据分析采用SPSS 16.0软件，Duncan法进行差异显著性分析，作图采用Excel软件。

2 结果与分析

2.1 树干注药对马尾松针叶叶绿素的影响

由图1可知，处理4 d时2种药剂均可导致总叶绿素，叶绿素a，b含量下降，其中氯氟氰虫酰胺处理叶绿素a含量降低最多（10.3%），但处理8 d后2种药剂又可引起总叶绿素，叶绿素a，b含量呈不同程度升高，仍以氯氟氰虫酰胺的刺激作用较为显著，16 d时叶绿素a含量较对照提高了10.5%。因此，树干注药对马尾松针叶内总叶绿素含量没有显著影响，但对叶绿素a含量有显著影响（表1）。

图1 树干注药对马尾松针叶叶绿素含量的影响Figure 1 Trunk injection of 2 pesticides on the chlorophyll content in leaves of P. massoniana

表1 树干注药后马尾松针叶叶绿素方差分析Table 1 ANOVA on chlorophyll content in leaves of P. massoniana after trunk injection

2.2 树干注药对可溶性总糖含量的影响

由图2可知，2种药剂处理对马尾松针叶中可溶性总糖含量有不同程度的影响。氯氟氰虫酰胺处理8 d时可溶性总糖含量最低，比对照降低15%，12 d达到最高；甲维盐注药4 d时可溶性总糖含量最高，12 d时可溶性总糖含量最低，比对照降低35%。由方差分析可知，不同药剂树干注射对马尾松针叶内总可溶性糖含量没有显著影响（表2）。

表2 树干注药后马尾松针叶可溶性糖方差分析Table 2 ANOVA on soluble sugar content in leaves of P. massoniana after trunk injection

图2 树干注药对针叶中可溶性总糖含量的影响Figure 2 Effect trunk injection of pesticides on total soluble sugar content of in leaves of P. massoniana

图3 树干注药后马尾松针叶内MDA含量的变化Figure 3 Effect trunk injection of pesticides on MDA content in leaves of P. massoniana

2.3 树干注药对马尾松针叶中MDA含量的影响

由图3可知，树干注药后MDA含量经历上升-下降的变化。2种药剂处理4 d时，MDA含量均达到最高，与对照相比均上升了42%；药后16 d时各药剂处理组的MDA含量均已接近对照水平。由表3可知，不同药剂树干注射对马尾松针叶内MDA含量有显著影响。

表3 树干注药后马尾松针叶丙二醛方差分析Table 3 Variance analysis of MDA content of P. massoniana by trunk injection

2.4 树干注药对马尾松针叶内SOD活性的影响

由表4可知，不同药剂树干注射对马尾松针叶内SOD酶活性有显著影响。由图4可知，树干注药后SOD活性呈上升-下降-上升-下降的波动变化。氯氟氰虫酰胺处理对SOD活性影响较显著，注药后4 d酶活性达到最高，与对照相比上升了39.5%；而甲维盐处理4 d后酶活性也达到最高，与对照相比上升了31.7%，而处理8 d时酶活性达到最低。药后16 d 2种药剂处理SOD活性均逐渐接近对照水平。

表4 树干注药后马尾松针叶SOD酶活性方差分析Table 4 ANOVA on SOD avtivity in leaves of P. massoniana after trunk injection

图4 树干注药后马尾松针叶内SOD酶活性的变化Figure 4 Effect of trunk injection of pesticides on SOD activity in leaves of P. massoniana

图5 树干注药后马尾松针叶内PAL酶活性的变化Figure 5 Effect of trunk injection of pesticides on PAL activity in leaves of P. massoniana

2.5 树干注药对马尾松针叶中苯丙氨酸解氨酶PAL活性的影响

树干注药后PAL活性经历上升-下降的变化，且氯氟氰虫酰胺对PAL酶活性影响显著（图5，表5）。2种药剂处理8 d后酶活性达到最高，其中氯氟氰虫酰胺处理与对照相比，酶活性上升了40.7%，之后迅速下降；而甲维盐处理后8 d，与对照相比酶活性上升了22.8%，随后缓慢下降。

表5 树干注药后马尾松针叶PAL酶活性方差分析Table 5 ANOVA on PAL activity in leaves of P. massoniana after trunk injection

3 结论与讨论

2种注干药剂经树干注射后对马尾松针叶内叶绿素、可溶性总糖、MDA含量和SOD、PAL酶活性均可产生一定的影响，进而可能会对马尾松的正常生理代谢产生一定的影响。2种注干药剂对叶绿素、可溶性总糖含量的影响主要表现为先抑制后增高，而对MDA含量的影响主要表现为先增高后降低。药剂处理后SOD、PAL活性均呈现出先上升、后抑制的波动变化，其中药剂氯氟氰虫酰胺对SOD、PAL活性影响较为明显。

农药使用后对非靶标植物生长[18]和生理代谢的影响日益受到研究人员的关注，垂柳Salix babylonicaLinn.树干注药后，导致其叶片叶绿素和可溶性蛋白含量下降，垂柳的正常生理代谢受到抑制[19]；桃Amygdalus persicaL.采用树干注药和叶面喷雾 2种施药方法，结果叶面喷雾造成叶绿素含量下降、净光合速率降低，而树干注药则增加叶绿素含量并提高净光合速率[20]，上述研究结果表明，农药可以抑制植物的生长和代谢。本研究结果表明，氯氟氰虫酰胺和甲维盐树干注药后可在短期内使马尾松针叶叶绿素、可溶性糖含量降低，表明该2种药剂对叶绿素、可溶性糖含量具有抑制作用，随着处理时间的延长，针叶抵制药剂富集作用后逐渐适应，叶绿素、可溶性糖含量又可恢复至对照水平，而 MDA含量先增加后减少，表明树干注药后马尾松的防御系统首先产生应激反应，生产大量MDA，随着时间的推移，药剂对马尾松的胁迫逐渐减弱，马尾松树体可通过自身的调节作用恢复正常的生理生化代谢水平。同时，氯氟氰虫酰胺树干注射不同程度地提高马尾松针叶内SOD，PAL的活性，这与唐光辉等[16]研究结果相一致。此外，脯氨酸（与细胞壁的形成有关）含量变化和其他生理指标测定在后续的试验中进行完善，同时将测定氯氟氰虫酰胺注干后土壤相关酶变化等，以便更好评价氯氟氰虫酰胺注干后对马尾松生长和代谢的影响。

树干注药的药剂使用不当会对树体产生药害，周家华等[21]进行柑橘Citrus reticulataBlanco保果试验时，大剂量使用“喷施灵”增加了柑橘的落果量；陈运全等[22]使用高浓度营养液注射柑橘枝干后导致受害枝叶全部脱落。本试验过程中发现，用30 mL氯氟氰虫酰胺和甲维盐液体制剂注射3 ～ 4年生马尾松苗时，导致部分松苗死亡，而注射5年生以上马尾松苗时，则未出现松苗死亡现象，表明药剂不论注干还是叶面喷施时使用剂量要适量。有关氯氟氰虫酰胺树干注射的有效剂量，药剂在马尾松树体内的残留时间以及马尾松树体应对氯氟氰虫酰胺胁迫和自我调节恢复机制，有待于进一步深入研究。

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