miRNA-34b/c-5p对乳腺癌中神经激肽1受体-截短型表达的影响*

乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其中远处转移是最主要的致死原因［1］。研究发现乳腺癌中miRNA-34b/c-5p低表达［2］，这使研究者开始关注其下游的致癌基因。神经激肽1受体（neurokinin 1 receptor，NK1R）的表达与肿瘤转移密切相关［3］，且通过生物信息学预测到其3'UTR区存在miRNA-34b/c-5p的结合位点。在结构上NK1R分为全长型（NK1R-full length，NK1R-FL）及截短型（NK1R-truncated，NK1R-Tr）。本课题组［4］前期发现NK1R-Tr在迁移侵袭能力较强的乳腺癌细胞中高表达，因此本研究旨在分析miRNA-34b/c-5p对NK1R-Tr的调控作用，及miRNA-34b/c-5p和NK1R-Tr对乳腺癌细胞迁移侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集2013年2月至5月50例天津医科大学肿瘤医院手术切除乳腺癌组织标本，均经病理学证实，其中乳腺浸润性导管癌46例、浸润性乳头状癌2例、髓样癌2例。采用美国癌症联合会（AJCC）乳腺癌指南（第七版）进行TNM分期，其中Ⅰ期14例、Ⅱ期21例、Ⅲ期15例。本研究获得本院伦理委员会批准，且得到受试者知情同意。

1.1.2 细胞与主要试剂 乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7细胞系来源于天津医科大学肿瘤医院公共实验室。miRNA-34b/c-5p、U6、NK1R-Tr、β-actin的PCR引物，miRNA-34b/c-5p模拟物、模拟物对照、miRNA-34b/c-5p抑制剂、抑制剂对照和NK1R-Tr的干扰试剂（siNK1RTr）均购自广州锐博生物科技有限公司；转染试剂Lipo2000购自美国Invitrogen公司；β-actin单克隆抗体购自美国Sigma-Aldrich公司；NK1R-Tr单克隆抗体购自美国Romantique&Distingue公司；HRP标记的羊抗鼠IgG购自英国Upstate公司；RT-PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR（RTPCR）扩增条件为95℃ 15 s、51～58℃（根据各基因不同）15 s、72℃45 s，共40个循环。目的基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法，其中-ΔΔCt=ΔC（t标准基因）-ΔCt（目的基因）。NK1R-Tr和β-actin引物序列见表1。

表1 NK1R-Tr和β-actin引物序列

1.2.2 蛋白免疫印迹实验 NK1R-Tr蛋白表达的方法参见本课题组前期研究［4］。

1.2.3 细胞转染 转染稀释液和Lipo2000稀释液分别室温孵育5 min，之后混合孵育20 min，缓慢加入细胞培养液中，继续培养6 h后换液。miRNA-34b/c-5p模拟物和抑制剂序列见表2。

1.2.4 划痕实验 细胞转染48 h后使用10 μL枪头在细胞表面进行划痕，更换无血清培养液，记录此刻为0 h。随机选取5个视野，使用倒置显微镜观察细胞从划痕处向中央迁移的情况，并分别于0、6、12、24 h拍照并记录两条划痕线间的距离。实验重复3次。

1.2.5 Transwell小室侵袭实验 细胞转染48 h后将细胞重悬，调整细胞密度为2.5×105/mL，取0.2 mL细胞悬液接种于含有基质胶的Transwell上室中，下室加入含10%胎牛血清的培养液，并放于细胞培养箱中培养，24h后对穿膜的细胞进行染色。实验重复3次。

表2 miRNA-34b/c-5p模拟物和抑制剂序列

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。多组数据采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较采用Student-Newman-Keuls法，Pearson相关系数分析乳腺癌组织中miRNA-34b-5p、miRNA-34c-5p和NK1R-Tr间的表达相关性。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-34b/c-5p和NK1R-Tr的表达量与乳腺癌进展的关系

在50例患者乳腺癌标本中，检测miRNA-34b/c-5p及NK1R-Tr的相对表达量发现，Ⅲ期乳腺癌患者组织中miRNA-34b-5p表达量明显低于Ⅱ期患者（P=0.043），但Ⅰ期与Ⅱ期和Ⅲ期相比，miRNA-34b-5p的表达量均无显著性差异（均P＞0.05）。Ⅲ期乳腺癌患者组织中miRNA-34c-5p的表达量明显低于Ⅰ期患者（P=0.041），但Ⅰ期与Ⅱ期、Ⅱ期与Ⅲ期相比，miRNA-34c-5p表达量均无显著性差异（均P＞0.05）。Ⅲ期乳腺癌患者组织中NK1R-Tr表达量明显高于Ⅰ期患者（P=0.038），但Ⅰ期与Ⅱ期、Ⅱ期与Ⅲ期相比，NK1R-Tr表达量均无显著性差异（均P＞0.05，图1）。发生淋巴结转移的乳腺癌患者组织中NK1R-Tr的相对表达量为5.75，而未发生淋巴结转移者相对表达量为4.29，两者比较差异具有统计学意义（P=0.026），但miRNA-34b/c-5p表达量均无显著性差异（均P＞0.05）。分析miRNA-34b/c-5p和NK1RTr表达相关性时发现，miRNA-34b-5p与miRNA-34c-5p的相对表达量呈正相关（r=0.762，P＜0.001），而miRNA-34b-5p与NK1R-Tr的相对表达量呈负相关（r=-0.672，P＜0.001），miRNA-34c-5p与NK1R-Tr的相对表达量亦呈负相关（r=-0.628，P＜0.001）。

2.2 乳腺癌细胞中miRNA-34b/c-5p和NK1R-Tr表达

乳腺癌MDA-MB-231细胞中miRNA-34b/c-5p的相对表达量低于MCF-7细胞，但NK1R-Tr表达高于MCF-7细胞（图2）。

2.3 miRNA-34b/c-5p对乳腺癌细胞中NK1R-Tr表达的调控

在乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞中，进行转染miRNA-34b/c-5p模拟物与转染模拟物对照比较，NK1R-Tr表达量降低，而进行转染miRNA-34b/c-5p抑制剂与转染抑制剂对照比较，NK1R-Tr表达量升高（图3）。

图1 miRNA-34b/c-5p及NK1R-Tr的表达与乳腺癌临床分期的关系

2.4 miRNA-34b/c-5p及NK1R-Tr对MDA-MB-231细胞迁移及侵袭能力的影响

过表达miRNA-34b/c-5p及敲低NK1R-Tr可以显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移及侵袭能力（均P＜0.001，图4）。

图2 乳腺癌细胞中miRNA-34b/c-5p和NK1R-Tr的表达

图3 乳腺癌细胞中miRNA-34b/c-5p对NK1R-Tr表达影响

图4 miRNA-34b/c-5p及NK1R-Tr对MDA-MB-231细胞迁移及侵袭能力的影响

3 讨论

全球女性癌症患者中乳腺癌的发生率及死亡率最高，其特点是局部浸润和远处转移的频率较高，很多患者被确诊时已为癌症进展期［5］。miRNA-34家族由位于染色体1p36的miRNA-34a，和共同位于11q23染色体的miRNA-34b和miRNA-34c组成，miRNA-34b/c-5p在miRNA-34b/c中占大多数［6］。研究认为位于同一条染色体的miRNA在癌症中也起着相似的生物学作用［2］。在乳腺癌相关研究中有关miRNA-34a的功能已相对明确［7-9］，但miRNA-34b/c的功能有待进一步探索。

本研究发现，乳腺癌组织中NK1R-Tr的相对表达量与乳腺癌TNM分期密切相关，其中Ⅲ期患者组织中NK1R-Tr的相对表达量明显高于Ⅰ期患者。另外在发生淋巴结转移的患者组织中，NK1R-Tr的相对表达量明显升高，这与本课题组的前期研究结果［4］一致。乳腺癌组织中miRNA-34b/c-5p的相对表达量与乳腺癌TNM分期及淋巴结是否转移无显著性差异，但Ⅲ期乳腺癌患者组织中miRNA-34b-5p的相对表达量明显低于Ⅱ期患者，miRNA-34c-5p的相对表达量明显低于Ⅰ期患者，考虑可能因Ⅱ期乳腺癌患者已出现淋巴结转移，但发生转移的淋巴结数量尚较少。因此miRNA-34b/c-5p有可能成为晚期乳腺癌的预测指标，提示NK1R-Tr可能也同时受到其他基因的调控，另外乳腺癌标本收集数量较少也可能是其中一个原因。此外，本研究进行miRNA-34b/c-5p和NK1R-Tr相关性分析时发现，miRNA-34b-5p与miRNA-34c-5p的相对表达量呈正相关，更加印证了位于同一染色体的miRNA有着相似的功能这一结论［2］。乳腺癌组织中miRNA-34b/c-5p与NK1R-Tr表达相关性也更加提示，miRNA-34b/c-5p可能通过靶向作用于NK1R-Tr，从而实现对乳腺癌的抑制作用。本研究发现迁移侵袭能力较强的MDA-MB-231细胞中miRNA-34b/c-5p表达量低于MCF-7细胞，这与多项研究结果［10-12］一致。而且本研究还发现，过表达miRNA-34b/c-5p可以抑制MDA-MB-231细胞的迁移及侵袭能力。上述所有研究结果均提示miRNA-34b/c-5p可能抑制乳腺癌的进展，其抑制作用可能通过调控NK1R-Tr来实现。

NK1R为G蛋白偶联受体家族中的一员，在乳腺癌、胃癌及非小细胞肺癌中均显著表达［13-15］。本研究发现在迁移侵袭能力较强的乳腺癌MDA-MB-231细胞中，NK1R-Tr表达量高于迁移侵袭能力较弱的MCF-7细胞，这与本课题组的前期研究结果一致［4］。在MDA-MB-231细胞中敲低NK1R-Tr可抑制细胞的迁移及侵袭能力，说明NK1R-Tr与乳腺癌的转移密切相关。另外，研究发现miRNA-34b/c-5p可负向调控NK1R-Tr表达，提示miRNA-34b/c-5p可能通过调控NK1R-Tr从而实现对乳腺癌的抑制作用。

综上所述，本研究主要对乳腺癌组织和细胞中miRNA-34b/c-5p与NK1R-Tr表达的相关性，及miRNA-34b/c-5p、NK1R-Tr对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响进行了分析，miRNA-34b/c-5p及NK1R-Tr可能成为抑制乳腺癌转移的潜在治疗靶点，但miRNA-34b/c-5p对NK1R-Tr的具体调控机制有待进一步研究。

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