骨髓间充质干细胞对小鼠肺脏缺血再灌注损伤的影响

孙常荣 侯念果 李会 帅训军 孙明洁 唐玉茹 徐堂文 艾登斌

[摘要]目的 探讨骨髓间充质干细胞对小鼠肺脏缺血再灌注损伤的影响。方法 采用全骨髓培养法分离纯化小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs），结扎左侧肺门60 min，再灌注240 min制备小鼠肺脏缺血再灌注损伤模型。70只小鼠随机分为7组（n=10），包括：假手术组（Sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、BMSCs 1组（尾静脉注射1×106个BMSCs）、BMSCs 2组（尾静脉注射2×106个BMSCs）、BMSCs 5组（尾静脉注射5×106个BMSCs）、BMSCs 10组（尾静脉注射10×106个BMSCs）、BMSCs it组（气管内注射5×106个BMSCs）。再灌注结束时抽取小鼠股动脉血，行血气分析，并计算氧合指数（PaO2/FiO2）。随后处死小鼠，取肺组织，采用ELISA法检测定肺组织中超氧化物歧化酶（SOD）的活性、白细胞介素（interleukin，IL）-8、肿瘤坏死因子（TNF-α）含量及髓过氧化物酶（MPO）的活性，光镜下观察肺组织损伤程度并进行病理学评分。结果 与Sham组比较，I/R组、BMSCs 1组、BMSCs 2组、BMSCs 5组、BMSCs 10组、BMSCs it组的PaO2/FiO2降低，肺组织病理学评分、MPO活性、IL-8、TNF-α含量升高，SOD活性降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与I/R组比较，BMSCs 1组、BMSCs 2组、BMSCs 5组、BMSCs 10组、BMSCs it组的PaO2/FiO2升高，肺组织病理学评分、MPO、IL-8、TNF-α水平降低，SOD活性升高，差异有统计学意义（P<0.05）；其中BMSCs 10组最明显，差异有统计学意义（P<0.05），气管内注射与血管内注射相同浓度BMSCs作用无明显区别，差异无统计學意义（P>0.05）。结论 BMSCs能够明显减轻肺组织缺血再灌注损伤，其作用机制与调节肺组织炎症反应有关，且具有明显量效关系，气管内注射与血管内注射相同浓度BMSCs作用无明显区别。

[关键词]骨髓间充质干细胞；肺；再灌注损伤；氧自由基

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）2（b）-0018-04

Influence of bone marrow mesenchymal stem cells on lung ischemia-reperfusion injury in mice

SUN Chang-rong1，2 HOU Nian-guo1 LI Hui1 SHUAI Xun-jun1 SUN Ming-jie1 TANG Yu-ru1 XU Tang-wen1，2 AI Deng-bin1▲

1.Department of Anesthesiology，Weifang Medical College，Shandong Province，Weifang 261053，China；2.Department of Anesthesiology，Research Center of Clinical Anesthesiology of Qingdao City，Qingdao Municipal Hospital，Shandong Province，Qingdao 266011，China

[Abstract]Objective To investigate the influence of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） on lung ischemia-reperfusion injury （LIRI） in mice.Methods BMSCs from rats were isolated，cultured and purified by the whole bone marrow acherence method.LIRI was produced by occlusion of the left hilum of lungs for 60 min followed by 240 min reperfusion.70 mice were randomly divided into 7 groups （n=10），included the sham operation group （the Sham group），the ischemia-reperfusion group （the I/R group），the BMSCs 1 group （tail vein injections of 1×106 BMSCs），the BMSCs 2 group （tail vein injections of 2×106 BMSCs），the BMSCs 5 group （tail vein injection of 5×106 BMSCs），the BMSCs 10 group （tail vein injection of 10×106 BMSCs），the BMSCs it group （endotracheal injection of 5×106 BMSCs）.At the end of reperfusion，blood samples were obtained for blood gas analysis and PaO2/FiO2 was calculated.Then，the animals were sacrificed and lung tissues were immediately removed for determination of superoxide dismutase （SOD），tumor necrosis factor-α （TNF-α），interleukin-8 （IL-8），and myeloperoxidase （MPO） and for microscopic examination of the pathological changes of lungs which were scored.Results Compared with Sham group，PaO2/FiO2 was significantly decreased，the pathological scores and the levels of TNF-α，IL-8，and MPO were increased，and SOD activity was decreased in I/R，BMSCs 1，BMSCs 2，BMSCs 5，BMSCs 10，BMSCs it group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Compared with I/R group，PaO2/FiO2 was significantly increased，the pathological scores and the levels of TNF-α，IL-8，and MPO in lung tissues were decreased，and SOD activity was increased in BMSCs 1，BMSCs 2，BMSCs 5，BMSCs 10，BMSCs it group，the difference was statistically significant （P<0.05）.The most obvious group is BMSCs 10，the difference was statistically significant （P<0.05）.There is no obvious difference between endotracheal injection and intravascular injection with the same concentration of BMSCs，the difference was not statistically significant （P>0.05）.Conclusion BMCS can alleviate LIRI in mice，and the responsible mechanism is related to inhibition of inflammatory responses.The lung protective effect is dose dependent.There is no significant difference between endotracheal injection and intravascular injection with the same concentration of BMSCs.

[Key words]Bone marrow mesenchymal stem cells；Lung；Reperfusion injury；Oxygen free radical

肺缺血再灌注损伤（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI）主要见于肺移植和体外循环手术的早期，是导致术后呼吸功能障碍及死亡的重要原因[1-2]，因此有必要探讨其有效的防治措施。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是具有多向分化能力的干细胞，体外易于迅速扩增，短期内便能得到治疗所需细胞量，可促进损伤组织修复，是细胞替代治疗的重要组成部分[3-4]。研究显示，BMSCs对小鼠肾缺血再灌注损伤有保护作用[5-6]，但其对LIRI的影响有待探讨。本研究旨在探讨BMSCs对小鼠LIRI的影响，现报道如下。

1对象与方法

1.1实验动物

健康雄性C57BL/6J小鼠70只，购买于武汉大学动物实验中心[SCXK（鄂）2015-0025]，6～8周龄，体重16～24 g。健康SD大鼠5只，购买自北京维通利華实验动物技术有限公司[SCXK（京）2012-0001]，4周龄，体重98～105 g。实验过程中对实验动物的处置符合动物伦理学标准。

1.2主要仪器和试剂

呼吸机：瑞世康医疗器械有限公司；低速高速离心机：上海安亭仪器有限公司；光学显微镜：Olympus公司；M200酶标仪：TECAN；流式细胞仪：北京达科为生物技术有限公司；ELISA试剂盒：南京建成科技有限公司；胎牛血清：美国gibco公司；高糖DMEM：美国gibco公司；双抗：上海泽迈生物技术有限公司；胰蛋白酶：康为世纪生物有限公司；PBS缓冲液：美国gibco公司；

1.3实验分组和处理

采用随机数字表法，将小鼠分为7组（n=10），包括假手术组（Sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、BMSCs 1组（尾静脉注射1×106个BMSCs）、BMSCs 2组（尾静脉注射2×106个BMSCs）、BMSCs 5组（尾静脉注射5×106个BMSCs）、BMSCs 10组（尾静脉注射10×106个BMSCs）、BMSCs it组（气管内注射5×106个BMSCs）。

根据文献[7]介绍的方法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞。大鼠脱臼处死后，用体积分数为75%的乙醇全身浸泡消毒10 min。无菌条件分离双下肢，磷酸盐缓冲液清洗3次。将股骨和胫骨的骨骺端剪掉，暴露出骨髓腔，用添加青、链霉素的培养基冲出骨髓，制成单细胞悬液，离心弃上清，重悬沉淀以1.0×109/L的细胞浓度接种于37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养。24 h首次半量换液，48 h后全量更换培养基，以后每3天全量更换新鲜培养基。待贴壁细胞达70%～80%融合时，用0.25%胰酶消化3～5 min，按1︰2的比例进行传代培养。收获第3代生长状态良好骨髓间充质干细胞，制成单细胞悬液，流式细胞仪进行检测分析骨髓间充质干细胞表面标志物。

参照文献[8]介绍的方法制备肺缺血再灌注损伤模型。小鼠腹腔注射0.1 mg/g氯胺酮+0.01 mg/g甲苯噻嗪进行麻醉，气管切开后，气管插管机械通气，潮气量0.6 ml，通气频率120次/min，吸呼比1∶2，吸入氧浓度100%。左胸部去毛，消毒局部皮肤，钝性分离第4、5肋间隙，充分暴露左侧肺门，经尾静脉注射肝素5 U/g，5 min后用血管钳于呼气末阻断左侧肺门，使左肺缺血60 min即为缺血期，然后移除血管钳解除阻断，再灌注左肺240 min形成再灌注期。再灌注的同时，I/R组经尾静脉注射磷酸盐缓冲液0.5 ml，BMSCs 1组经尾静注射1×106个BMSCs，BMSCs 2组经尾静脉注射2×106个BMSCs，BMSCs 5组经尾静脉注5×106个BMSCs，BMSCs 10组经尾静脉注射10×106个BMSCs，BMSCs it组经气管内注射5×106个BMSCs。实验过程中持续经静脉输注生理盐水450 μl/h，并维持直肠温37～38℃，Sham组只开胸。于再灌注结束时抽取小鼠股动脉血，进行血气分析，并计算氧合指数（PaO2/FiO2）。

1.4观察指标及检测方法

放血处死小鼠，取左下肺组织，称重后，按重量体积比加入9倍的生理盐水制成10%组织匀浆，4℃离心取上清液，采用酶联免疫吸附分析法（ELISA）测定SOD、IL-8、TNF-α、MPO的含量。

取左下肺组织，10%甲醛溶液固定、常规石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察各组标本组织学改变。在400倍视野下随机选择10个非重叠视野，参照文献[9]进行病理学损伤评分，取其平均值。1分：肺组织结构正常；2分：肺间质轻度充血和中性粒细胞轻度浸润；3分：血管周围水肿形成，肺组织结构部分破坏，中性粒细胞中度浸润；4分：肺组织结构严重破坏，大量中性粒细胞浸润。

1.5统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用多样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1七组小鼠PaO2/FiO2和肺组织病理学损伤评分的比较

与Sham组比较，I/R组、BMSCs 1组、BMSCs 2组、BMSCs 5组、BMSCs 10组、BMSCs it组的PaO2/FiO2降低，肺组织病理学损伤评分升高（P<0.05）。与I/R组比较，BMSCs 1组、BMSCs 2组、BMSCs 5组、BMSCs 10组、BMSCs it组的PaO2/FiO2升高，肺组织病理学损伤评分降低（P<0.05）。BMSCs 1组、BMSCs 2组、BMSCs 5组、BMSCs 10组、BMSCs it组的上述指标比较，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.2七组小鼠肺组织各测定指标水平的比较

与Sham组比较，I/R组、BMSCs 1组、BMSCs 2组、BMSCs 5组、BMSCs 10组、BMSCs it组的SOD降低，MPO、IL-8、TNF-α水平升高（P<0.05）。与I/R组比较，BMSCs 1组、BMSCs 2组、BMSCs 5组、BMSCs 10组、BMSCs it组的SOD升高，MPO、IL-8、TNF-α降低（P<0.05）。BMSCs 1组、BMSCs 2组、BMSCs 5组、BMSCs 10组、BMSCs it组的上述指标比较，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

3讨论

本研究参照文献[8]介绍的方法采用夹闭小鼠左侧肺门（包括气管、肺动脉、肺静脉）60 min，再灌240 min制备小鼠肺缺血再灌注损伤模型。结果显示，与Sham组比较，I/R组的PaO2/FiO2降低，光镜下和电镜下均可见病理改变，肺组织病理学损伤评分升高，提示模型制备成功。

参照文献[7]介绍了全骨髓培养法分离纯化小鼠骨髓间充质干细胞。本研究选择在再灌注的同时，I/R组经尾静脉注射磷酸盐缓冲液0.5 ml，BMSCs 1组经尾静注射1×106个BMSCs，BMSCs 2组经尾静脉注射2×106个BMSCs，BMSCs 5组经尾静脉注射5×106个BMSCs，BMSCs 10组经尾静脉注射10×106个BMSCs，BMSCs it组经气管内注5×106个BMSCs。结果显示，与I/R组比较，不同浓度BMSCs组的PaO2/FiO2升高，肺组织病理学损伤评分降低，且呈量效关系，提示注射BMSCs可减轻小鼠肺缺血再灌注损伤。

LIRI发生机制十分复杂，尚未完全阐明，目前研究认为，可能与氧自由基引起的氧化损伤密切相关[10-12]。生理状态下，体内氧自由基的生成和清除处于动态平衡，但在LIRI时通过吞噬细胞系统、线粒体呼吸链等途径释放大量氧自由基。氧自由基是器官缺血再灌注后致组织损伤最早、最重要的有害物质之一[13]。SOD为机体中清除自由基的酶，可清除氧自由基，其活性代表了组织抗氧化损伤的能力。本研究结果显示，与I/R组比较，经尾静脉和气管内注射不同浓度BMSCs组的SOD水平升高，提示注射BMSCs可通过清除氧自由基，减轻小鼠肺缺血再灌注损伤。

中性粒细胞浸润是导致LIRI的重要原因之一[14-17]。活化的中性粒细胞通过脱颗粒释放MPO和其他蛋白水解酶及炎症介质，导致肺泡毛细血管膜损伤，发生渗透性肺水肿，出现肺弥散功能障碍[18]。通常情况下中性粒细胞是在炎症介质的趋化下迁移到肺组织中[19]。TNF-α及IL-8是中性粒细胞主要的趋化因子[20-21]。本研究结果显示，与I/R组比较，经尾静脉和气管内注射不同浓度BMSCs组的MPO、TNF-α、IL-8的水平降低，提示注射BMSCs可通过抑制肺组织炎性反应，减轻小鼠肺缺血再灌注损伤。

综上所述，经尾静脉和气管注射BMSCs可减轻小鼠肺缺血再灌注损伤，其机制与清除氧自由基和抑制肺组织的炎症反应有关。

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（收稿日期：2017-10-24 本文编辑：祁海文）