植物乳杆菌微胶囊化研究

罗红霞,李晓红,田文静,张 俊,王 建,林少华

(1.北京农业职业学院,北京 102442;2.江西农业大学,江西南昌 330045)

植物乳杆菌作为益生菌,对人类和动物健康有着重要的促进作用[1],如调节胃肠道生态平衡、增强免疫力、降低胆固醇高血压和抑制肿瘤前体物质形成等功能[2-5]。目前,已广泛应用于保健品、功能性食品、微生态添加剂等的研发和使用[6-7]。虽然植物乳杆菌的功效已经得到不少专家证实,但却难以有足够数量的活菌到达肠道而发挥作用。其主要原因是植物乳杆菌到达胃肠道消化系统后,受到胃酸、胆汁和其他一些消化酶等的影响而丧失活性[8-9]。

而微胶囊技术是提高乳酸菌存活率的一项高新技术[10-11],它能达到较好的缓释效果[12],成为国内外研究的热点。常用的微胶囊制备方法主要包括:喷雾干燥法、挤压法、乳化法、凝聚法、流化床包埋空气悬浮法和静电法等[13-14]。喷雾干燥是在干燥室中将物料雾化,再利用热空气将物料中水分迅速汽化,得到干燥产品[15]。该方法具有成本低廉、适用性广泛、生产效率高等优点,更适合工业化推广应用[16-17]。韩冬冬等[18]利用喷雾干燥法对土壤石油中污染生物修复的革兰氏阴性细菌进行微胶囊化后,菌的活性和稳定性得到有效提高。

蛋白质如小麦蛋白、牛奶蛋白、乳清蛋白和明胶常用作微胶囊的壁材[19-21]。乳清蛋白和明胶是在食品工业中被广泛使用的材料,其来源广泛,无毒无害,价格低廉,具有良好的生物相容性。

本实验以乳清蛋白和明胶为复合壁材,利用喷雾干燥和生物微胶囊技术,将青贮饲料中优良植物乳杆菌进行包埋,并应用响应面法优化植物乳杆菌微胶囊工艺,以期提高该菌体在胃肠道消化系统中的存活率。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

菌种 采自河北省廊坊市固安县天然发酵玉米青贮饲料;乳清蛋白(食品级)、明胶(分析纯)、MRS液体培养基、MRS固体培养基、磷酸氢二钾(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)、胰蛋白酶(酶活力≥2500.0 U/mg) 北京化学试剂公司。

LDZF-30KB-II型高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂;DNP-9082恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司;普通光学显微镜55i 日本OYLMPUS;PHS-3C精密pH计 上海雷磁仪器厂;DT502A电子天平 常熟市砝码仪器有限公司;L-117型喷雾干燥器 北京来亨科贸有限责任公司;R134A离心机 德国EPPENDORF。

1.2 实验方法

1.2.1 植物乳杆菌的活化 依据文献[22]中的方法将植物乳杆菌,按3%的接种量,接种于30 mL的MRS液体培养基中,置于37 ℃的恒温培养箱,静置培养24 h,同样方法重复2次活化,使菌种活力达到0.6以上,备用。

1.2.2 菌悬液制备 将活化好的植物乳杆菌按3%的接种量,接种于30 mL的MRS液体培养基中,置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h后,于4000 r/min离心5 min,4 ℃后、收集菌体,再用无菌生理盐水调节菌悬液的浓度为5.12×109cfu/mL,于4 ℃的冰箱中备用。

1.2.3 微胶囊包埋工艺 取一定量的按照参照文献[23]配制好的乳清蛋白溶液,于40 ℃ 加热,置于搅拌器中搅拌,4000 r/min高速分散 10 min至完全溶解,静置待泡沫消去后加入20 mL在1.2.2中制备的植物乳杆菌菌悬液,于40 ℃ 加热、搅拌(500 r/min,5 min)搅拌,同时加入一定量的明胶溶液搅拌均匀。置于均质机中均质(25 MPa、50 ℃)设置一定的进料速度与进风温度,最后喷雾干燥器制备植物乳杆菌微胶囊。

1.2.4 人工肠液配制 称取磷酸氢二钾3.4 g,加入250 mL的蒸馏水溶解,再用0.1 mol/L的氢氧化钠调节pH到6.8,另外,取5 g胰蛋白酶,用适量蒸馏水将其溶解,再将两溶液混合均匀,最后用蒸馏水定容至500 mL,于4 ℃下储藏备用。

1.2.5 微胶囊单因素实验

1.2.5.1 壁材配比对包埋植物乳杆菌包埋率的影响 在壁材添加量为 15%,进风温度为120 ℃,进料量为25%,壁材质量配比(乳清蛋白:明胶)分别为1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5的情况下,考察植物乳杆菌微胶囊包埋率随壁材配比变化的影响。

1.2.5.2 壁材添加量对包埋植物乳杆菌包埋率的影响 在壁材配比(乳清蛋白与明胶质量比)为1∶1.5,进风温度为120 ℃,进料量为25%,壁材添加量分别为10%、15%、20%、25%的情况下,考察植物乳杆菌微胶囊包埋率随壁材用量变化的影响。

1.2.5.3 进风温度对包埋植物乳杆菌包埋率的影响 在壁材配比(乳清蛋白与明胶质量比)为1∶1.5,壁材添加量为20%,进料量为25%,进风温度分别为110、120、130、140 ℃的情况下,考察植物乳杆菌微胶囊包埋率随进风温度变化的影响。

1.2.5.4 进料量对包埋植物乳杆菌包埋率的影响 在壁材配比(乳清蛋白与明胶质量比)为1∶1.5,壁材添加量20%、进风温度为120 ℃,进料流量分别为20%、25%、30%、35%的情况下,考察植物乳杆菌微胶囊包埋率随进料量变化的影响。

1.2.6 响应面优化实验设计 在单因素的实验基础上,对影响植物乳杆菌包埋率的四个因素壁材配比、壁材添加量、进风温度、进料量设计三水平优化实验,如表1所示。

表1 Box-Behnken实验因素及水平编码表Table 1 Box-Behnken experimental factors and levels coding table

1.2.7 植物乳杆菌包埋率测定 取喷雾干燥后的微胶囊样品1 g,置于99 mL人工肠液(pH=6.8),于37 ℃恒温振荡器振荡45 min后,活菌计数[24-25]。

菌体包埋率(%)=1 g样品中的活菌总数×所得样品质量/喷雾干燥前加入的植物乳杆菌的活菌总数×100

1.3 数据处理

实验结果利用Excel和Design-Expert 8.0.6进行实验数据处理和方差分析。

2 结果和分析

2.1 单因素实验

2.1.1 壁材配比(乳清蛋白与明胶质量比)对包埋植物乳杆菌包埋率的影响 从图1中可以看出,随着壁材配比(乳清蛋白与明胶质量比)的比值减小,包埋率先增加后降低,当乳清蛋白与明胶的质量比为1∶1.5时,植物乳杆菌微胶囊的包埋率最高,达到60.3%,初步确定壁材配比(乳清蛋白与明胶质量比)为1∶1.5作为响应面优化条件。

图1 壁材配比(乳清蛋白∶明胶)对包埋率的影响Fig.1 Effect of the ratio of wall material on encapsulation yield注：*表示与本因素水平1的结果相比，包埋率有显著影响(p<0.05)，图2～图4同。

2.1.2 壁材添加量对植物乳杆菌包埋率的影响 从图2中可以看出,随着壁材添加量的增加,包埋率先增加后降低,壁材添加量为20%时,植物乳杆菌微胶囊包埋率最高,达到58.7%;当壁材添加量<20%时,由于壁材量不足,使植物乳杆菌暴露在外,在喷雾干燥过程中,会导致包埋效果变差。因此,初步确定壁材添加量为20%作为响应面优化条件。

图2 壁材添加量对包埋率的影响Fig.2 Effect of wall material on encapsulation yield

2.1.3 进风温度对包埋植物乳杆菌包埋率的影响 从图3中可以看出,随着进风温度的增加,包埋率先增加后降低,当进风温度为120 ℃时,植物乳杆菌微胶囊包埋率最高,达到62.7%,超过或低于该温度,均影响微胶囊包埋率。因此,初步确定进风温度为120 ℃作为响应面优化条件。

图3 进风温度对包埋率的影响Fig.3 Effect of the inlet air temperature on encapsulation yield

2.1.4 进料量对包埋植物乳杆菌包埋率的影响 从图4中可以看出,随着进料量的增加,包埋率先增加后降低,进料量为30%时,植物乳杆菌微胶囊包埋率最高,达到52%,当进料量<30%,由于塔内的进风温度不变,过少的进料量会使植物乳杆菌受到高温的伤害,导致活性降低,但当进料量超过30%时,过高的进料量会使塔内的含水量增加,影响植物乳杆菌在微胶囊内的稳定性,使其包埋率下降。因此,初步确定进料量为30%作为响应面优化条件。

图4 进料量对包埋率的影响Fig.4 Effect of the feed rate on encapsulation yield

2.2 响应面实验设计及结果

通过对表2中的数据进行处理,利用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析,得到各因素对植物乳杆菌微胶囊包埋率的二次回归方程为:

表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

Y(%)=58.97-3.01A+4.55B+3.43C+1.41D+1.17AB+1.22AC+0.43AD+0.48BC-2.05BD+1.73CD-4.67A2-3.38B2-3.52C2+0.20D2。

方差分析结果见表3,模型的p小于0.01,说明该二次回归方程具有高度的显著性,失拟项p=0.1133>0.05,说明该模型与实验实际拟合良好,实验误差小,较好地反映了植物乳杆菌微胶囊包埋率与壁材配比、壁材添加量、进风温度和进料量的关系。一次项中A、B、C对包埋率的影响极显著(p<0.01),二次项中除D2不显著(p>0.05)外,其余的二次项都显著,交互项不显著(p>0.05)。

表3 回归模型方差分析结果Table 3 Regression model analysis of variance results

2.3 交互效应分析

为了探讨交互作用的影响,使其中的两个因素固定为0水平,得到交互效应方程分别为:

Y(A、B)(%)=558.97-3.01A+4.55B+1.17AB-4.67A2-3.38B2

Y(A、C)(%)=558.97-3.01A+3.43C+1.22AC-4.67A2-3.52C2

Y(A、D)(%)=558.97-3.01A+1.41D+0.43AD-4.67A2+0.20D2

Y(B、C)(%)=558.97+4.55B+3.43C+0.48BC-3.38B2-3.52C2

Y(B、D)(%)=558.97+4.55B+1.41D-2.05BD-3.38B2+0.20D2

Y(C、D)(%)=558.97+3.43C+1.41D+1.73CD-3.52C2+0.20D2

由图5可以看出，在制备植物乳杆菌微胶囊的过程中,随壁材配比、壁材添加量、进风温度、进料量四个因素的增加,对植物乳杆菌微胶囊的包埋率均呈现先增加后减小的趋势,表明在选定的各变量因素范围内可以出现最大包埋率。故利用喷雾干燥法制备植物乳杆菌微胶囊,其包埋率存在最大值。

图5 两因素交互作用对包埋率的影响响应面图Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of emulsifier quantity,the core material ratio,casein and the solid concentration on encapsulation yield

2.4 最适工艺参数确定

对实验结果进行处理,得到喷雾干燥法制备微胶囊的最优组合为:壁材配比为1∶1.93、壁材添加量为22%、进风温度为127.40 ℃、进料量为35%,包埋率预测值为63.15%。为了能在实际操作过程中更好的控制条件,调整实际条件为:壁材配比为1∶2、壁材添加量为22%、进风温度为127 ℃、进料量为35%,在此条件下,制得的植物乳杆菌微胶囊的实际包埋率为62.15%,与模型预测值相比,其相对偏差较小。因此,基于响应面法所得的优化喷雾干燥法制备植物乳杆菌微胶囊的工艺参数准确可靠,具有实用价值。

3 结论

经实验得到喷雾干燥法制备固安县玉米秸秆中植物乳杆菌微胶囊的最优实际条件为:壁材配比1∶2、壁材添加量22%、进风温度127 ℃、进料量35%,最终得到的植物乳杆菌微胶囊包埋率为62.15%。乳清蛋白-明胶复合壁材包被植物乳杆菌微胶囊化效果较理想,提高了植物乳杆菌的应用价值,对工业生产有指导作用,为青贮饲料添加剂系列产品研发提供了新思路。

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