两种心肌纤维化动物模型基本情况比较

徐为民，孙 志，陈 欢，时景伟

(吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033)

心肌纤维化动物模型在心血管疾病基础实验中占有重要地位，目前较常见的实验动物心肌纤维化造模方法有：自发性高血压大鼠心肌纤维化、糖尿病大鼠心肌纤维化、二肾一夹及肾下主动脉缩窄模型、腹主动脉缩窄法等，其中主动脉缩窄法是近几年较为主流的心肌纤维化及心衰造模方法，本文将主动脉缩窄法与经典的异丙肾上腺素法作一简单比较，初步探讨两者的优势与缺点。

1 材料与方法

1.1动物BALB/c雄性SPF级小鼠40只，体重17-24 g，约8周龄，由吉林大学实验动物中心提供，实验过程符合动物伦理学标准。

1.2试剂与仪器盐酸异丙肾上腺素注射液(上海丰禾制药有限生公司生产)，异氟烷(德国费森尤斯公司生产)，小动物麻醉系统(加拿大Visualsonics公司)，小动物超声(加拿大Visualsonics公司)。羊抗小鼠UII(尾加压素Ⅱ)单克隆抗体、羊抗小鼠GPR14(尾加压素受体)多克隆抗体(由Santa Cruz公司提供)； SP-免疫细胞化学试剂盒(由北京中衫金桥生物技术有限公司提供)等。

1.3造模40只小鼠随机分为4组，每组10只，分别为正常对照组、异丙肾组、sham组和TAC组。异丙肾组腹部皮下注射Iso10 mg/kg，每天1次，正常对照组，每天皮下注射生理盐水，TAC组于异氟烷麻醉下行胸切口，主动脉弓瞬时夹闭手术，Sham组只行开胸及缝合，不做主动脉弓夹闭。至1周时，每组随机取5只，行心脏彩超后摘取心脏进行染色。至3周时，同样处置。

1.4心脏彩超将小鼠置于加热板上保持体温恒定，适当调整超声探头以获取胸骨旁长轴图像，测量左心室舒张末期内径(LVEDD)，左心室收缩末期内径(LVESD)，左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短分数(LVFS)。

1.5方法HE、天狼星红染色，按常规染色法进行操作。免疫组织化学染色按试剂盒说明书操作。 染色后在每张切片左心室尖部随机选取5个高倍镜视野(×200)，用病理图像分析系统对所选视野内阳性信号进行图像分析，计算不同时间点的各组小鼠心肌组织阳性信号吸光度(A)。

2 结果

2.1一般情况正常对照组及sham组小鼠一般状态佳，行为敏捷，皮毛光滑茂盛。异丙肾组3天时死亡1只，3周时死亡一只，其余8只精神萎糜，有明显掉毛，行为迟缓，食欲明显减退。TAC组手术时死亡1只，术后24小时死亡一只，其余8只精神略萎糜，轻度掉毛，活动度较异丙肾组略好。Sham组手术时死亡一只，其余9只活动度及食欲均良好。

2.2心脏彩超异丙肾组造模1周时只有左室舒张末期内径明显增大，左室射血分数明显下降，而3周时四项指标均明显变化。而主动脉缩窄组在一周时只表现为左室射血分数下降，至三周时四项指标也出现显著变化。异丙肾组和TAC组在第一周的指标变化没有差距，而在第三周时均出现明显差别。见表1。

2.3HE染色1周时正常对照组心肌细胞排列整齐，横纹清晰，胞核染色明显，无细胞肿胀。Sham组基本同正常对照组。异丙肾组则出现心肌细胞肥大，排列疏松紊乱，大小不一，细胞核大小不一，肌纤维增粗，散在坏死灶，部分区域肌纤维完全溶解，核异质性明显，心肌间质可见纤维组织增生。TAC组也出现上述改变，但程度较轻，见图1。3周时，正常对照组与Sham组无明显变化。异丙肾组坏死病灶面积增大，病灶内出现较多纤维化，坏死程度明显比1周时增大。TAC组坏死程度及纤维化程度较1周时明显加重，但较异丙肾组为轻。见图2。

**与正常对照组比较，P<0.01.##与sham组比较，P<0.01.&与异丙肾组比较，P<0.05.&&与异丙肾组比较，P<0.01

图1 1周时各组心肌HE染色，A正常对照组，B 异丙肾组，C sham组，D TAC组

图2 3周时各组心肌HE染色，A正常对照组，B 异丙肾组，C sham组，D TAC组

2.4天狼星红染色1周时正常对照组心肌胶原表达较少，Sham组亦较少，异丙肾组胶原纤维组织轻度增生，心内膜下、间质中胶原沉积量轻度增加，TAC组无明显增加。见图3。3周时正常对照组与Sham组均无明显变化，异丙肾组胶原明显增加，TAC组也明显增加，但较异丙肾组为轻。见图4。

图3 1周时各组心肌天狼星红染色 A正常对照组，B 异丙肾组，C sham组，D TAC组

图4 3周时各组心肌天狼星红染色 A正常对照组，B 异丙肾组，C sham组，D TAC组

2.5UII及UT蛋白表达情况UII免疫组织化学染色显示：正常对照组及sham组在心尖及心内膜可见极少量阳性表达的心肌细胞和成纤维细胞，且不随时间延长而改变。1周后，异丙肾组及TAC组UII阳性产物即明显增加，呈黄褐色(P<0.01)，3周后，这两组UII阳性产物表达明显比1周多(P<0.01)，且阳性产物主要分布在坏死灶周围。UT免疫组化染色结果与UII同步。见图5-8、表1。

图5 1周时UII染色 A正常对照组，B异丙肾组，C TAC组，D sham组

图6 1周时UT染色 A正常对照组，B异丙肾组，C TAC组，D sham组

图7 3周时UII染色 A正常对照组，B异丙肾组，C TAC组，D sham组

图8 3周时UT染色 A正常对照组，B异丙肾组，C TAC组，D sham组

组别正常对照组(n=10)1周(n=5)3周(n=5)异丙肾组(n=8)1周(n=4)3周(n=4)Sham组(n=9)1周(n=4)3周(n=5)TAC组(n=8)1周(n=3)3周(n=5)UⅡ(A*103)2.63±0.242.74±0.1815.78±2.96**16.81±3.12**2.76±0.182.81±0.216.27±0.70##13.56±2.24##UT(A*103)2.8±0.82.9±1.015.9±4.1**17.9±3.9**2.9±0.73.0±0.87.5±1.2##14.6±3.1##

**与正常对照组比较P<0.01.##与sham组比较P<0.01.

3 讨论

异丙肾上腺素使小鼠心率加快，心率持续强烈收缩，心肌因相对缺血导致坏死及纤维化，出现心脏功能衰竭[1]。而主动脉缩窄法造成心脏压力负荷增加，心肌逐渐肥厚、重塑，最终造成心功能恶化[2]。

本研究首次将此两种方法进行对比，通过HE和天狼星红染色结果可以看出，在同样的周期下，异丙肾上腺素法致心肌纤维化程度较主动脉缩窄法高，这可能与异丙肾上腺素的剂量变异性较大有关[3,4]，也可能由于心肌缺血和高血压导致心肌纤维化的机制略有不同[5]。具体原因尚待进一步探讨。

本实验的心脏彩超结果提示，异丙肾组对心脏功能的影响出现较早且较显著，这与其他学者的研究相当[6]，而主动脉缩窄法对心脏形态和功能的影响在3周时均不明显。根据其他研究团队的结论，TAC法需要4-6周才能出现对左室大小、EF和FS的显著影响[2]。

在本研究中，TAC组的死亡率与ISO组相当，TAC组与sham组死亡小鼠主要死于术中及术后并发症，提示TAC的手术风险高，技术难度大，但ISO组对小鼠机体损伤更大。此结论尚需大例数试验证实。

心肌纤维化(MF)主要表现为心肌胶原浓度显著升高，涉及RAAS(肾素-血管紧张素-醛固酮)系统及免疫系统参与，多种细胞因子、细胞信号传导系统均与MF发生有关[7]。两组均出现UII及UT的蛋白表达升高，说明在心肌缺血及高血压导致的心肌纤维化机制中，均有尾加压素Ⅱ及其受体的参与，这已在多个研究中被证明[8-11]。

综上所述，异丙肾造模法造模速度快、周期短、技术难度低，但造模过程中小鼠死亡率较高，可作为急性心肌纤维化研究模型。而主动脉缩窄法虽然技术要求高、造模速度慢，但致死率相对略低，适宜作为慢性心肌纤维化模型进行试验。

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