山东省携带blaNDM-5基因大肠埃希菌的分子流行病学研究

李宜雷,赵 辉，贾 楠，董丹丹，刘真真，朱元祺，*

(1.青岛大学医学院，山东 青岛266071；2.青岛大学附属医院，山东 青岛266003)

碳青霉烯类抗生素被认为是目前临床上治疗革兰氏阴性菌感染的最后一道防线。近年来随着这类抗生素的广泛使用，碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌(CRE)的分离率也呈上升趋势[1,2]。新德里金属β-内酰胺酶-1型(NDM-1)是一种常见的碳青霉烯酶，是Ambler分类中B类β-内酰胺酶[3]。研究发现，近几年不断检出该基因的不同亚型。新德里金属β-内酰胺酶-5型(NDM-5)是Hornsey[4]于2011 年报道的新亚型。随后，陆续有在不同的国家和地区检出产NDM-5肠杆菌的报道，且报道逐年增加。同NDM-1一样，此类酶水解除氨曲南外的几乎所有β内酰胺类抗生素，常常也携带其他耐药基因，表现对喹诺酮类、氨基糖苷类和四环素类等临床常用抗生素耐药，但Hornsey等[4]试验还表明NDM-5酶的水解活性要高于NDM-1酶。因此，对携带blaNDM-5基因的肠杆菌进行研究，有助于针对性制定医院感染预防和控制指南。为此，我们收集了山东省3家医院临床实验室2015年3月-2016年12月间分离的20株对亚胺培南耐药的大肠埃希菌，筛选其携带的blaNDM-5基因，然后对这些NDM-5阳性菌株的耐药表型和耐药基因型及其同源性进行研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集济南、济宁和青岛市3家医院于2015年 3月-2016年12月临床分离的对亚胺培南耐药的大肠埃希菌20株。这些菌株重新用法国梅里埃公司Vitek-2 Compact全自动微生物分析系统进行细菌的鉴定和药敏。药物敏感性判定依据美国临床实验室标准化研究所2016 年 CLSI M100S-26标准执行。仪器的质控菌株为ATCC27853、ATCC25922、ATCC700323、ATCC700324、ATCC35218和ATCC700603，为本实验室保存。沙门氏菌H9812 菌株(脉冲场凝胶电泳Marker)由青岛市疾病控制中心惠赠。

1.2 主要仪器和试剂

PCR扩增仪、脉冲场凝胶电泳仪(CHEF-DR Ⅲ)和全自动凝胶成像系统均为美国Bio-Rad 公司。Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR buffer、DL2000maker、S1和 Xba I核酸酶购自大连宝生生物(Takara公司)。

1.3 耐药基因分析

热裂解法提取菌株DNA，首先PCR扩增和产物测序确定菌株携带的blaNDM-5基因，然后，再对阳性菌扩增其他碳青霉烯酶耐药基因(KPC、IMP、VIM、OXA-48、BIC、SPM、AIM、GIM、SIM和SIM)、超广谱β-内酰胺酶基因(TEM、SHV、CTX-M和OXA-1)、氨基糖苷和喹诺酮类耐药基因[acc(6')Ib，qnrA、qnrB、qnrC、qnrD和qnrS]。引物序列及 PCR 扩增参数参照文献[5,6]。各引物合成和PCR 扩增产物由上海生工生物(上海)工程股份有限公司完成。测序结果与GenBank数据库比对确定耐药基因型。

1.4 多位点序列分型(MLST)

按照大肠埃希菌MLST 网站提供的7个管家基因的引物(adk，fumC，gyrB，icd，mdh，purA，recA)序列进行扩增，测序结果在该网站进行比对得出菌株的序列分型(http://enterobase.warwick.ac.uk/species/ecoli/allele_st_search)。

1.5 脉冲场凝胶电泳(PFGE)

对产NDM-5的大肠埃希菌进行PFGE分析，操作步骤和结果判读参照Tenover相关文献[5,7]。沙门菌H9812菌株和临床菌株用限制性内切酶XbaI一样处理，并作为Marker。电泳参数：温度14℃、分子量30 kb-700 kb、场强6 V/cm、转角120°、转换时间2.16-63.8 s、电泳时间18 h。

2 结果

2.1 携带blaNDM-5基因大肠埃希菌的药敏结果

用法国梅里埃公司Vitek-2 Compact对收集分纯后的20株大肠埃希菌重新进行细菌的鉴定和药敏试验，并PCR扩增和测序确定菌株是否携带NDM-5基因。经检测，其中11株大肠埃希菌携带blaNDM-5基因，且这11株菌对包括碳青霉烯酶类在内的β-内酰胺类抗生素耐药率最高，除对氨曲南耐药率82%外，均高达100%耐药率。对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素和磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的耐药率也比较高，分别为54%、73%、73%和64%。仅有1株对左氧氟沙星和环丙沙星敏感，其余10株均呈现耐药。但是，所有11株菌对呋喃妥因未出现耐药(敏感率36%，中介率64%)。结果见表1和表2。

2.2 菌株耐药基因检测和多位点序列分型结果

除了经扩增和测序比对确认11株菌携带blaNDM-5基因外，且每一株菌还携带多个其他耐药基因，如CTX-M-55、OXA-1、TEM-1和acc(6')Ib等耐药基因。11株菌中，6株分离自尿液，痰液和脓液各2株，血液1株。多位点序列分型显示这11株大肠埃希菌共分为7个ST型，以ST167为主，共4株(36.4%，4/11)， 其他分别为ST617型2株(18.2%，2/11)，ST46、ST453、ST448、ST6388和ST410型各1株。详见图1和表2。

2.3 脉冲场凝胶电泳PFGE结果

脉冲场凝胶电泳结果显示，经与沙门菌H9812菌株比对，这11株大肠埃希菌的脉冲电泳条带数目、位置均不相互一致，依据Tenover规则判定，都属于暴发不相关(Unrelated)菌株，即山东省三个医院虽然都存在携带blaNDM-5基因大肠埃希菌的流行，但在医院内或三个医院间没有呈现菌株的克隆聚集性，都属于散发克隆。详见图2。

表1 11株携带blaNDM-5基因大肠埃希菌临床株的药敏结果(μg/mL)

表2 11株产NDM-5大肠埃希菌携带的耐药基因和多位点序列分型

M：DL2000 marker；Lane1：NDM-5；Lane2：CTX-M；Lane3：TEM-1；Lane4：OXA-1 ；Lane5：阴性对照

图1耐药基因PCR扩增产物电泳图

3 讨论

自新德里金属β-内酰胺酶-1型(New Delhi metallo-β-lactamase 1，NDM-1)2009年在印度首次报道[3]以来，携带该基因的细菌已被发现在全球范围流行并引发多种类型感染[1,8]。携带blaNDM 菌由于编码β-内酰胺酶的基因点突变，已报道有多个亚型，其中以NDM-1亚型最多见[8]。许多变异亚型(如NDM-2 和NDM-3)与NDM-1 具有相似的水解活性，原因在于酶活性中心部位没有发生突变。blaNDM-5首次报道于1株ST648型大肠埃希菌，是 NDM 型碳青霉烯酶的另一种亚型，与 NDM-1只有 2个氨基酸的差别(Val88Leu，Met154Leu)，但比NDM-1具有更高的酶活性[4]。随后，在英国、印度、阿尔及利亚、日本和中国也有被发现的报道[9-13]。

M：沙门菌H9812；Lane1-11：1-11号携带blaNDM-5基因大肠埃希菌

11株菌药敏试验显示，除氨曲南外，对所有β-内酰胺类药物耐药，同时对氨基糖苷类抗生素(阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素)、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶、喹诺酮类抗生素(左氧氟沙星和环丙沙星)部分敏感。氨曲南的化学结构与金属β-内酰胺活性位点(MBL)没有足够的分子交互作用，因而有两株blaNDM-5大肠埃希菌对氨曲南没有发生水解，但其他9株NDM-5大肠埃希菌由于携带其他β-内酰胺酶等耐药基因，因而氨曲南显示耐药。β-内酰胺酶抑制剂阿维巴坦对大多数β-内酰胺酶有作用，氨曲南和阿维巴坦混合物可能是治疗产NDM耐药菌感染的最佳方案，尤其是当其他β-内酰胺酶存在时[14]。

11株菌除了携带blaNDM-5基因外，还携带多个其他耐药基因。本试验菌株82%携带CTX-M，55%携带acc(6’)Ib和TEM-1，27%携带OXA-1，呈现多重耐药表型和基因型，这给临床治疗带来了困难。MLST的结果表明11株大肠埃希菌属于7种不同的ST分型，以ST167型为主，共4株，占36.4%， 其他分别为ST617型2株(18.2%)，ST46、ST453、ST448、ST6388和ST410型各1株。经检索，除了ST167和ST448型外[13,15]，携带blaNDM-5基因的ST617、ST46、ST453、ST6388和ST410型大肠埃希菌为国内外首次报道。目前，国内外尚未有NDM-5菌株引起暴发流行的报道。与之相符的是，我们的PFGE结果同样呈现出不同的脉冲带型，即来自山东省三家医院菌株的同源性差异较大，均为散发病例。虽然，这些菌株未发现流行病学上的联系，但鉴于携带blaNDM-5细菌的高水平耐药，应引起足够的重视。

综上所述，山东省三家医院都检测到携带blaNDM-5基因的大肠埃希菌，以ST167型为主，没有呈现克隆聚集性，属于散发病例。但是，山东省存在未见报道的多位点序列分型的携带blaNDM-5基因的大肠埃希菌的流行。因此，公共卫生部门和医院应做好耐药监测和医院感染预防和控制工作，防止克隆传播引起的医院感染暴发。

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