瑞舒伐他汀对动脉硬化中巨噬细胞极化的影响

王海良，王守涛

0 引言

动脉粥样硬化(Arteriosclerosis，AS)发病初期是泡沫细胞形成。巨噬细胞形成泡沫细胞的过程与巨噬细胞亚型改变相关[1-2]。正常情况下，M2型巨噬细胞能吞噬脂质，被摄取的脂质激活肝X受体(Liver X receptors，LXRs)，增加ATP结合盒转运体(ATP binding cassette transporter，ABC)A1，ABCG1表达及其介导的脂质转运，将胞内的脂质运出[3-4]。当以上过程出现障碍，脂质在胞内堆积，刺激M2型巨噬细胞转化为M1型巨噬细胞，M1型巨噬细胞产生大量促炎因子，并造成脂质堆积，导致粥样斑块形成。瑞舒伐他汀是临床常用的降脂药，通过抑制HMG-CoA还原酶来抑制低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白的合成[5]。研究发现，瑞舒伐他汀除了能抑制脂质产生，还能抑制巨噬细胞免疫相关因子的表达，但机制不明确。本研究通过探讨瑞舒伐他汀对AS中巨噬细胞亚型的影响，探讨瑞舒伐他汀对巨噬细胞功能影响的机制，为临床治疗AS提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选择7周龄雄性SPF级SD大鼠36只，体重(180±20)g。每日定时喂水喂食，室温控制在(23±2)℃，按昼夜12 h节律活动。

1.1.2 主要试剂 瑞舒伐他汀(阿斯利康，英国)，一抗抗体来自Cell signaling technology(美国)，二抗来自Invitrogen(美国)。

1.2 研究方法

1.2.1 分组和大鼠动脉粥样硬化模型的构建 将SD大鼠随机分为对照组(CON组)12只和模型组24只，模型组再分为动脉硬化组(AS组)12只和药物组(R组)12只。CON组在实验第1天右侧后肢股部肌注生理盐水，花生油灌胃2次，普通饲料喂养4周，再开始生理盐水灌胃加普通饲料喂养4周。AS组在实验第1天右侧后肢股部肌注维生素D3300 kU/kg，含尼古丁25 mg/kg花生油灌胃2次，高脂饮食喂养4周，再开始生理盐水灌胃加高脂饲料喂养4周。R组在AS组基础上，在高脂饮食4周后，用瑞舒伐他汀[5 mg/(kg·d)]灌胃4周，同时进行高脂饮食。大鼠动脉粥样硬化模型参照赵娟等[6]的AS大鼠模型构建,构建完成后，超声及病理可以检测到动脉粥样硬化斑块。

1.2.2 取材 模型构建8周后，用水合氯醛将大鼠处死，切取大鼠胸主动脉组织10 mm，去除血管外膜上的组织，其中5 mm用4%多聚甲醛固定，进行主动脉病理形态学检测，5 mm剪碎，加入Lysis buffer处理，进行免疫印迹检测。

1.2.3 主动脉病理形态学检测 取胸主动脉横断进行连续取材，将样品放入4%多聚甲醛中固定24 h，行石蜡包被，切片，通过脱蜡，染色，脱水，透明，固封等步骤进行HE染色，光学显微镜观察动脉内膜形态。

1.2.4 巨噬细胞极化情况 使用免疫印迹法检测巨噬细胞极化情况,将Lysis buffer处理的样片离心，13 000 r/min，4 ℃，15 min，取上清置于新的EP管中。取2 μL样品，使用BCA法测定蛋白浓度。加缓冲液将样品蛋白浓度调至一致，加热至95 ℃变性5 min。将样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，通过转膜，封闭，一抗二抗孵育，扫膜，分析条带灰度。M1的表面标记物为CD86，M2的表面标记物为CD168，内参为β-actin，标记物与β-actin比值代表巨噬细胞极化情况。

1.2.5 炎症因子在血管组织中的表达 使用免疫印迹方法检测干扰素(IFN)-γ、白介素(IL)-4在血管组织中的表达情况。

2 结果

2.1 瑞舒伐他汀对主动脉形态的影响 结果显示，CON组的胸主动脉内膜光滑，内皮细胞排列整齐密集，内弹力层完整，中层平滑肌细胞排列整齐，无斑块形成。AS组内膜明显增厚，内膜下有平滑肌细胞增生，斑块形成，泡沫细胞聚集。R组内膜增厚，有平滑肌增生和脂质沉积，但比AS组减轻。见图1。

2.2 瑞舒伐他汀对巨噬细胞极化的影响 结果显示，AS组CD86水平明显高于CON组和R组，R组CD86明显高于CON组，R组CD168水平明显高于AS组和CON组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图1 大鼠胸主动脉壁HE染色(400×)

图2 瑞舒伐他汀对巨噬细胞极化的影响

2.3 瑞舒伐他汀对主动脉炎症因子表达的影响 结果显示，AS组IFN-γ水平明显高于CON组和R组，R组IFN-γ明显高于CON组，R组IL-4水平明显高于AS组和CON组，且差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 瑞舒伐他汀对主动脉炎症因子表达的影响

3 讨论

巨噬细胞接受一定刺激分化为不同亚型的过程称为巨噬细胞极化，其中Th1刺激形成M1型巨噬细胞，Th2刺激形成M2型巨噬细胞。巨噬细胞极化受不同因素调节，IFN-γ刺激产生M1型巨噬细胞，具有促炎作用，表面表达大量清洁受体(Scavenger receptor，SR)，介导细胞吞噬oxLDL[7]。IL-4、IL-10、糖皮质激素刺激产生M2型巨噬细胞，具有强抗炎作用，产生抗炎因子IL-10、IL-6，抑制M1型巨噬细胞产生等[8]。

瑞舒伐他汀是新型的HMG-CoA还原酶抑制剂，具有强效的降脂作用，是目前治疗心脑血管疾病的常用药物。本研究发现，瑞舒伐他汀能有效改善动脉粥样硬化，增加M2巨噬细胞比例和IL-4表达。IL-4能促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化，M2型巨噬细胞可以抑制胆固醇在细胞内沉积。所以瑞舒伐他汀改善动脉粥样硬化的原因可能是促进IL-4分泌，从而促进M2型巨噬细胞分化，减少胆固醇沉积和斑块形成。研究显示，他汀类药物能直接参与免疫调节，增加IL-4、IL-10等抗炎症因子的转录和表达，减少IFN-γ等促炎症因子的转录和表达，从而促进M2型巨噬细胞分化[9]。本研究提示，瑞舒伐他汀除了有强效降脂作用，还能通过促进M2型巨噬细胞分化来抑制粥样斑块形成，防止AS发生。

参考文献：

[1] Ferrante CJ,Pinhal-Enfield G,Elson G,et al.The adenosine-dependent angiogenic switch of macrophages to an M2-like phenotype is independent of interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα) signaling[J].Inflammation,2013,36(4):921-931.

[2] Boyle JJ,Johns M,Kampfer T,et al.Activating transcription factor 1 directs Mhem atheroprotective macrophages through coordinated iron handling and foam cell protection[J].Circ Res,2012,110(1):20-33.

[3] Bories G,Colin S,Vanhoutte J,et al.Liver X receptor activation stimulates iron export in human alternative macrophages[J].Circ Res,2013,113(11):1196-1205.

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[5] Giunti S,Calkin AC,Forbes JM,et al.The pleiotropic actions of rosuvastatin confer renal benefits in the diabetic Apo-E knockout mouse[J].Am J Physiol Renal Physiol,2010,299(3):F528-F535.

[6] 赵娟,李相军,孙波,等.维生素D3联合高脂饲料建立大鼠动脉粥样硬化模型[J].实用医学杂志,2009,25(21):3569-3571.

[7] Marino F,Maresca AM,Cosentino M,et al.Angiotensin II type 1 and type 2 receptor expression in circulating monocytes of diabetic and hypercholesterolemic patients over 3-month rosuvastatin treatment[J].Cardiovasc Diabetol,2012,11:153.

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[9] Cho KY,Miyoshi H,Kuroda S,et al.The phenotype of infiltrating macrophages influences arteriosclerotic plaque vulnerability in the carotid artery[J].J Stroke Cerebrovasc Dis,2013,22(7):910-918.