竹叶总黄酮通过抑制Nox4减轻H2O2诱导的成骨细胞氧化损伤

季泽娟，张春旭，郭占豪，刘方娜，刘 鑫

0 引言

骨质疏松属于全身代谢性疾病，调查显示，在50岁以上人群中其发病率为50%，发病后骨折给患者带来长期慢性疼痛，严重影响患者生活质量，因此，探究其机制对于骨病的治疗十分重要[1]。氧化应激反应和机体大多数疾病的发生发展相关，有研究显示，氧化应激反应与骨质疏松疾病间存在密切联系，参与骨质疏松发展过程[2]。竹叶黄酮是从竹叶中提取的有效成分，具有提高免疫力、抗菌、抗氧化、抗衰老、保护心脑血管的功效[3]。本研究以M3T3-E1细胞作为研究对象，制备细胞H2O2氧化损伤模型，通过不同生物学检测方法探究竹叶总黄酮对M3T3-E1细胞的保护作用，以及与Nox4蛋白间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 M3T3-E1成骨细胞购自于中国科学院细胞库。

1.2 仪器与试剂 竹叶总黄酮购自中美华东杭州有限公司，含量为92%，CO2培养箱购自Forma Scientific公司，低温离心机、蛋白凝胶成像仪购自Bio-Red公司，胎牛血清、α-MEM培养基购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自美国Amresco公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒、碱性磷酸酶染色剂购自碧云天公司；ALP检测试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、茜素红购自美国Sigma公司；2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购自宝生物工程(大连)有限公司。兔抗鼠Nox4抗体均购自美国Gibco公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二体购自美国R&D公司；RNA提取和反转录试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 M3T3-E1细胞培养 M3T3-E1细胞常温下解冻后，加入5 mL PBS缓冲液洗涤，添加0.2%胰蛋白酶进行消化后，于α-MEM培养基中终止消化，加入10% FBS的α-MEM培养液，移液枪吹打培养液使细胞密度为106个/m3，置于5% CO2培养箱内培养，当细胞贴壁生长达到80%时，加入胰蛋白酶消化，用α-MEM培养基洗涤3次，800 r/min离心3 min，收集细胞。按照1∶3比例进行传代培养，第3代细胞用于后续研究。

1.3.2 实验分组 将细胞分为5组，正常组：正常培养基进行培养；损伤组：正常培养48 h后加入150 μmol/L H2O2溶液继续培养；药物处理组：在培养基中添加50 μg/mL竹叶总黄酮提取物培养M3T3-E1细胞48 h，加入同等量H2O2溶液诱导培养4 h；空白转染组：MC3T3-E1细胞转染NC siRNA后加入150 μmol/L H2O2溶液；NOX4转染组(E组)：MC3T3-E1细胞转染NOX4 siRNA后加入150 μmol/L H2O2溶液。

1.3.3 细胞上清液中SOD、MDA、LDH、ROS含量测定 收集培养后的细胞，离心后保留上清，加入PBS溶液清洗，按照SOD、MDA、LDH检测试剂盒进行测定。在细胞上清液中加入浓度为10 μmol/L的DCFH-DA荧光探针溶液，在37 ℃孵育20 min，PBS洗涤细胞，采用多功能酶标仪检测荧光强度。

1.3.4 钙结节染色、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色 钙结节染色：培养后的细胞用PBS溶液清洗后置于70%乙醇中固定1 h，加入PBS溶液清洗3次，加入配置好的茜红素染色剂染色30 min，PBS清洗后，置于显微镜下观察记录。ALP染色：细胞培养后，用PBS溶液进行清洗，消化离心后保留细胞沉淀，加入培养基重悬细胞，接种于放置载玻片中，随后采用钙钴法进行染色，操作方法：PBS溶液冲洗玻片后进入冷丙醇中10 min，流水冲洗3次，每次3 min，加入ALP孵育液，37 ℃孵育4 h，蒸馏水冲洗2 min，加入2%硝酸钴溶液37 ℃孵育5 min，蒸馏水洗5 min，加入1%的硫化铵中2 min。加入中性树脂进行封片，置于100倍显微镜下，进行细胞计数。ALP活性检测：细胞采用ALP活性检测试剂盒进行测定，具体操作按照说明书进行。ALP活性率(%)=活性细胞数量/细胞总数×100%。

1.3.5 MTT法检测M3T3-E1细胞活力 将生长至对数期的M3T3-E1细胞接种于α-MEM培养基中，制备细胞悬浮液提纵横细胞密度为5×104/个，各组细胞按照“1.3.2”项培养结束后加入20 μL MTT，37 ℃反应4 h，去除细胞上清液后加入200 μL DMSO，37 ℃孵育20 min，于波长490 nm下测定各组的浓度，细胞存活率=OD实验组/OD空白组×100%。

1.3.6 流式细胞仪检测M3T3-E1细胞凋亡情况 将培养后的细胞制备单细胞悬浮液，密度调整为103个/m3，加入PBS溶液洗涤，阴性对照组仅添加200 μL DMSO溶液；正常组、损伤组、处理组、转染组、空白转染组：加入100 μL DMSO和20 μL PI，避光反应20 min，采用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

1.3.7 Western blot检测Nox4蛋白的表达 收集处理后的细胞液提取细胞总蛋白，BCA法测定提取后蛋白的浓度，配制8%、12%的分离胶与浓缩胶，取30 μg蛋白进行上样，蛋白Marker 5 μL，样品进入浓缩胶电压设置为80 V，进入分离胶后电压为120 V，反应结束将蛋白凝胶转移至PVDF膜上，加入脱脂牛奶进行封闭4 h，加入一抗(兔抗鼠Nox4单抗)4 ℃震荡过夜，加入PBS溶液清洗3次，每次10 min，加入辣根过氧化酶标记的二抗，室温下反应2 h，加入PBS溶液清洗3次，每次10 min。将蛋白凝胶用EXL发光后，在暗室中曝光，利用凝胶成像仪对Western blot产生的条带进行定量分析。

2 结果

2.1 细胞上清液中SOD、MDA、LDH、ROS含量测定 与正常组、药物处理组、NOX4转染组比较，损伤组、空白转染组SOD含量降低，MDA、LDH、ROS含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)；正常组、药物处理组、NOX4转染组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 ALP染色、钙结节染色结果 ALP染色显示，与正常组比较，损伤组、空白转染组成骨细胞大量损伤，数量明显减少，药物处理组、NOX4转染组细胞损伤程度小于损伤组，细胞数量有所增加。茜红素染色显示，损伤组细胞钙结节数量少于正常组，药物处理组、NOX4转染组钙结节数量多于损伤组；与损伤组、空白转染组比较，正常组、药物处理组、NOX4转染组ALP活性升高，差异有统计学意义(P<0.05)；正常组、药物处理组、NOX4转染组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、图2。

表1 各组细胞上清液中SOD、MDA、LDH、ROS含量对比

注：与损伤组、空白转染组比较，*P<0.05

图1 各组M3T3-E1成骨细胞ALP染色、钙结节染色

图2 各组ALP活性对比

2.3 M3T3-E1细胞活力测定与凋亡情况 MTT测定结果显示，损伤组细胞活力明显降低，药物处理组、NOX4转染组细胞活力增高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。流式细胞仪检测显示，A组细胞未出现大量凋亡，损伤组、空白转染组细胞出现大量凋亡，药物处理组、NOX4转染组凋亡细胞数量降低，见图4。

图3 MTT法测定M3T3-E1细胞活性

图4 各组M3T3-E1细胞凋亡情况

2.4 Nox4蛋白的表达情况 蛋白灰度扫描结果显示，与正常组、药物处理组、NOX4转染组比较，损伤组、空白转染组M3T3-E1细胞Nox4蛋白相对表达量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

3 讨论

骨质疏松症发病原因主要为成骨细胞与破骨细胞的不平衡，最新研究发现，机体抗氧化能力降低能够促进骨吸收，此外，氧化应激也是导致较多退化性疾病，如骨质疏松、衰老的重要诱因，氧化应激失调能够损伤骨，破坏细胞内成分，进而加速骨质疏松的进程，因此，研究成骨细胞氧化应激机制对于预防骨质疏松十分重要[4-5]。

目前，研究氧化应激的实验方法主要有动物法、生化检测法和细胞模型法[6]。国外学者研究发现，在制备后的大鼠氧化损伤模型中，由于受到实验周期、动物生存率等因素的影响，会给实验结果带来较大的误差[7]。ABTS、DPPH是常用的化学检测方法，操作简便、检测迅速，在对抗氧化剂氧化能力测定方面效果较好，但无法对机体内氧化能力进行准确测定[8]。细胞模型能够模拟机体内部环境，且试验周期较短[9]。本研究采用细胞模型在细胞水平上对氧化机制进行深入探究。H2O2化学性质稳定且容易获取，国外有学者通过制备H2O2细胞损伤模型，探究细胞内ROS、MDA变化以及对细胞活性的影响[10]，通过制备H2O2细胞损伤模型，探究虾青素对损伤细胞的保护作用[11]。参照相关文献中H2O2处理浓度最佳值为150 μmol/L，细胞内相关蛋白酶以及氧化物积累最多[12]，因此，选择150 μmol/L H2O2处理4 h。研究显示，H2O2处理使细胞损伤后，能够明显降低成骨细胞数量，提高破骨细胞活性，降解骨基质，加重病情程度，细胞中氧化自由基数量升高，与细胞膜中不饱和脂肪酸结合后生成MDA，因此，测定MDA能够反映细胞损伤程度[13-14]。SOD主要作用为增强机体过氧化能力，消除氧自由基，通过将超氧阴离子还原为过氧化氢，转变为水，降低体内自由基的含量[15]。LDH主要参与机体糖类氧化能量代谢，其数值的改变反映机体能量的变化以及细胞活力的变化[16]。机体内ROS水平过高导致脂类氧化反应加剧，细胞生物膜遭到破坏，逐渐老化、衰亡，此外，还能够使蛋白酶失活[17]。本研究结果显示，与正常组比较，损伤组SOD含量降低，MDA、LDH、ROS含量升高，经过竹叶总黄酮处理后SOD含量升高，MDA、LDH、ROS含量降低，表明成骨细胞损伤与细胞过氧化能力增强、氧自由基清除力下降有关，而在给予竹叶总黄酮处理后，细胞损伤程度明显降低，提示竹叶总黄酮能降低细胞过氧化能力，提高氧自由基清除力，进而发挥对成骨细胞的保护作用。研究显示，竹叶总黄酮处理后，能够先后提高细胞活力及细胞内CAT、SOD水平，降低细胞内ROS、MDA水平，提示在细胞氧化损伤中具有一定的抗氧化作用，本研究结果与之相符合[18]。

国内外较多研究均证明，NADPH氧化酶在调控细胞增殖、凋亡以及细胞内ROS的生成方面发挥关键作用[19]。NOX-4属于NADPH氧化酶中的一个亚型，主要表达于血管内皮细胞中，研究显示，通过抑制NOX-4活性，能够降低细胞氧化应激中细胞内皮的损伤[20]。研究表明，NOX-4是内皮细胞氧化应激以及功能失衡的重要因子，阻断NOX-4蛋白的表达能够明显减轻对细胞的氧化损伤[21]。研究显示，Nox4与氧化应激引起的股骨头坏死相关，Nox-ROS信号途径是股骨头坏死重要的发病机制[22]。本研究结果显示，阻断Nox4蛋白表达后，SOD含量明显升高，MDA、LDH、ROS含量明显降低。且ALP染色显示，转染NOX4，siRNA细胞损伤程度降低，成骨细胞数量明显升高，钙结节数量也明显增加，与竹叶总黄酮处理后结果相似。ALP与钙结节染色是评价细胞成骨能力的重要检测方法，研究表明，ALP是成骨细胞中重要的膜结合蛋白，能够分解磷酸化合物产生磷酸盐离子，进而与钙离子反应生成羟磷灰石，聚集于骨组织中，茜红素能使富含钙离子的物质着色[23]。本研究结果显示，ALP染色后，转染组与竹叶总黄酮处理组细胞数量增多，表明在阻断NOX4或添加竹叶总黄酮处理后细胞成骨能力增加，且茜红素染色也显示钙结节数量增多，进一步说明阻断NOX4或添加竹叶总黄酮处理后，能够保护细胞氧化损伤，促进骨形成。研究表明，细胞经过H2O2处理后会发生早期凋亡，明显抑制细胞增殖活性[24]。本研究细胞流式仪检测结果表明，细胞氧化损伤后，出现明显凋亡，而阻断NOX4或添加竹叶总黄酮处理后，细胞凋亡明显降低，表明竹叶总黄酮对细胞氧化损伤引起的凋亡具有一定的保护作用，而且可能与阻断NOX4相关。蛋白检测结果显示，阻断NOX4或添加竹叶总黄酮处理后，NOX4蛋白表达量均明显升高，这可能是由于细胞经过H2O2处理氧化损伤后，细胞内DNA链断裂，导致复制、转录水平降低，因此，蛋白水平也因之降低。

本研究设计存在一定的缺陷，在进行干预H2O2处理中，并未设计多个时间点进行观察，可能对研究结果造成一定的误差，后续应深入研究。综上所述，竹叶总黄酮对H2O2诱导的成骨细胞氧化损伤具有一定的保护作用，其机制可能与抑制Nox4蛋白表达有关。

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