利用GT1-7细胞体外研究雌激素对GnRH分泌及其相关基因表达的影响

陈志龙， 吴晓敏， 郑 琛， 许晓玲， 白佳桦， 刘 彦， 冯 涛

(1. 甘肃农业大学 动物科学技术学院， 兰州 730070； 2. 北京市农林科学院 畜牧兽医研究所， 北京 100097)

繁殖活动是动物生产系统中的重要活动，初情期的启动则是动物繁殖活动的开始。而初情期的启动则依赖于神经内分泌生殖轴下丘脑-垂体-性腺轴的活化[1]。下丘脑GnRH神经元分泌的促性腺激素释放激素GnRH能够刺激垂体腺分泌促卵泡素FSH、促黄体素LH以及催乳素PRL，进而促进性腺的发育与成熟并分泌雌激素(estrogen，E2)以维持性腺机能以及发情表现。当体组织发育不完全时，雌激素与其受体结合调控下丘脑弓状核区域的Kisspeptin神经元对GnRH神经元产生负反馈效应，抑制性腺发育；而当体组织发育成熟时，雌激素通过调控下丘脑前腹侧室旁核Kisspeptin神经元对GnRH神经元产生正反馈，促进性腺发育及发情表现[2]。因而，雌激素对下丘脑GnRH神经元的正负反馈调控，是确保动物正常性发育和启动初情期的关键。研究雌激素及其受体对GnRH分泌的调控机理是深入揭示动物初情期启动机理的关键组成部分。然而GnRH神经元在动物脑内不超过3000个，弥散的分布于前脑，体内研究较为困难。

近年来，利用小鼠永生GT1-7细胞系体外研究GnRH神经元的脉冲分泌及相关基因表达的研究较多。GT1-7细胞系可作为GnRH神经元的离体模型，其无论表型形态，激素分泌方式、相关基因及蛋白表达均与GnRH神经元一致，且能在体外无限分裂传代，遗传信息稳定，因而被认为是下丘脑GnRH神经元的体外理想细胞模型[3]。前人的研究表明，低浓度pM级雌激素能够促进GnRH的分泌，因此本实验利用高浓度1 μmol/L雌激素对GT1-7细胞处理不同时间研究高浓度雌激素对GnRH分泌及GnRH相关基因(GnRH、KISS-1、ERα和GPR54 mRNA)表达的影响，为进一步研究GnRH合成和分泌的调控提供依据。

1　材料

1.1　仪器及材料

本实验所用GT1-7细胞为美国加州大学Mellon教授惠赠，主要仪器包括常规细胞培养设备，荧光定量PCR仪、凝胶成像系统(Bio-Rad公司)等。主要试剂包括DMEM高糖培养液、胎牛血清、青链霉素混合液(Gbico公司)、17β-雌二醇(Sigma公司)、细胞培养上清GnRH检测试剂盒(TSZ公司)，以及细胞总RNA提取试剂盒、第一链合成试剂盒、快速荧光定量检测试剂盒(天根公司)等。

2　方法

2.1　GT1-7细胞培养

本实验主要材料为GT1-7细胞系，获得后对其进行复苏及细胞传代以扩大培养，满足实验所需的所有细胞，当细胞稳定传代后将处于对数增长期的细胞进行冻存以避免污染，稳定传代。

将GT1-7细胞从液氮取出后，37℃水浴复苏于含有10%胎牛血清(FBS)、1%青/链霉素双抗的DMEM高糖培养液中，然后900 r/min离心4 min，在超净工作台中使用新鲜的完全培养液重悬后接种于培养瓶，培养于恒温37℃、饱和湿度、5% CO2的无菌培养箱中，每隔24 h更换新的培养液。待GT1-7细胞长满至培养瓶底面的80%～90%时，使用0.25%的胰酶(Try-EDTA)消化，待细胞开始从培养瓶壁上掉落时使用含有血清的完全培养液终止消化，900 r/min离心4 min，重悬后接入新的培养瓶进行传代。培养3代以上细胞状态稳定时可用于实验研究，本实验所用细胞在3～15代之间。

2.2　雌激素处理GT1-7细胞

GT1-7细胞在培养瓶底面汇合至80%～90%时可消化重悬后用于实验。将得到的GT1-7细胞悬液使用细胞计数仪测其密度，根据浓度稀释至2×105个/mL的浓度均匀接种至12孔板中，每孔2 mL，每个处理3个重复，培养于二氧化碳恒温培养箱。待细胞汇合至80%～90%时，取出至无菌工作台，轻轻吸去培养液，各孔用1 mL PBS洗涤2遍以去除血清对实验的干扰，然后每孔接入2 mL无血清DMEM配制的1 μmol/L雌激素溶液，重新置于二氧化碳培养箱并计时。

GT1-7细胞培养至特定的处理时间(0、6、12、18、24和30 h)便从培养箱中取出，吸取细胞培养液并收集细胞。培养液用无菌Ep管收集，2000 r/min离心20 min，取上清液测定GnRH浓度。细胞沉淀的收集使用胰蛋白酶处理法，吸除多余培养液，用磷酸盐缓冲液PBS洗涤细胞2次，然后向细胞中加入200 μL 0.25%胰酶消化至脱离容器壁时，使用含有血清的完全培养液终止消化，吹打混匀后将细胞悬液转移至RNase-Free Ep管中，300 r/min离心5 min后加入细胞裂解液裂解，震荡混匀后立即提取RNA或于-80℃冰箱待测。

2.3　细胞总RNA提取

GT1-7细胞总RNA的提取使用天根生化科技有限公司离心柱型“RNAprep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒”，按照使用说明在室温下操作，将提取的RNA液收集于RNase-Free离心管，使用分光光度计测RNA浓度和纯度后，立即进行反转录或于-80℃冰柜保存。

2.4　逆转录为cDNA

本次实验采取“TIANGEN Quantscript RT Kit Quant cDNA第一链合成试剂盒”进行反转录，根据反转录的体系及RNA浓度计算体系中各成分的添加体积。反转录实验过程在冰上进行，然后使用PCR仪37℃孵育60 min。得到cDNA产物，可于-20℃储存。反转录体系为：Super pure dNTPs、10×RT Mix、Oligo-(dT)15和Quant Reverse Transcriptase分别为2.0、2.0、2.0、1.0 μL，然后根据RNA的浓度计算其添加量并使用ddH2O补足至总体积20 μL。

2.5　Real-time PCR

采用FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)快速荧光定量PCR预混试剂盒进行相对荧光定量检测基因表达，选择PRL19作为内参基因，引物序列参考已发表文献(表1)。

表1 Real-time PCR引物序列

PCR反应体系为：2×FastFire qPCR PreMix 10.0 μL、Primer各0.5 μL、cDNA 1.0 μL、ddH2O 8.0 μL，反应总体积为20.0 μL。

反应程序为：95℃预变性1 min；95℃变性5 s，退火10 s(退火温度见表1),72℃延伸15 s,总计40个循环数。

使用荧光定量软件Bio-Rad CFX Manager 3.1读取荧光信号记录Ct值。

2.6　激素测定

实验使用美国TSZ公司生产的小鼠GnRH酶联免疫标记检测试剂盒检测GT1-7细胞GnRH的分泌。使用已知浓度的标准品制作GnRH标准曲线，然后利用酶标仪根据样品在420 nm处的吸光值，计算样品GnRH浓度。具体操作按照试剂盒使用说明进行。

2.7　数据统计与分析

基因表达根据荧光定量软件自动读取的Ct值即荧光信号到达阈值的循环数，采用2-△△Ct法计算对照组与实验组的相对基因表达[4]。△Ct值为目的基因Ct值减去内参基因Ct值，实验组Ct值减去对照组Ct值得到△△Ct。使对照组目的基因表达量为2-△△CT=1，目的基因在模板中的相对表达量为2-△△CT，则2-△△CT值大于1表示促进目的基因表达，反之则抑制目的基因表达。

3　结果与分析

3.1　雌激素处理不同时间对GT1-7细胞GnRH分泌的影响

1 μmol/L的雌激素处理GT1-7细胞0、6、12、18、24及30 h对GT1-7细胞GnRH分泌的影响结果见图1。

图1 1 μmol/L雌激素不同时间点处理GT1-7对GnRH分泌的影响

如图1所示，与对照组相比，1 μmol/L雌激素处理组GnRH分泌量在开始培养的6 h和12 h有所升高(P>0.05)，在培养18 h和30 h则极显著降低(P<0.01)。

3.2　PCR产物电泳分析

将样品提取RNA反转录后的cDNA分别以PRL19、GnRH、ERα、KISS-1和GPR54为引物进行PCR扩增，将产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，其大小依次为185、247、235、154和204 bp(图2)，得到的产物大小与预期相符。

图2 PRL19、GnRH、ERα、KISS-1及GPR54的PCR产物电泳图

1～5依次表示PRL19、GnRH、ERα、KISS-1和GPR54基因产物的电泳条带

图3 1 μmol/L E2处理不同时间对GT1-7细胞GnRH、ERα、KISS-1、GPR54基因表达的影响

3.3　雌激素处理不同时间对GT1-7细胞GnRH分泌相关基因表达的影响

1 μmol/L的雌激素处理GT1-7细胞0、6、12、18、24及30 h，GT1-7细胞GnRH分泌相关基因的表达结果如图3。与对照组相比，在整个培养过程中1 μmol/L E2处理组各基因表达呈降低趋势。GnRHmRNA表达除0 h外其他各培养阶段较对照组显著降低(P<0.01)；处理组KISS-1 mRNA表达较对照组极在各时间点都有降低趋势，且在培养12 h时极显著降低(P<0.01)；培养12 h和18 h，E2处理组ERαmRNA表达较对照组极显著降低(P<0.01)；GPR54 mRNA表达较对照组在培养6、12和24 h极显著降低(P<0.01)。

4　讨论

4.1　雌激素处理对GT1-7细胞GnRH分泌的影响

动物的繁殖活动是中枢神经系统综合内源及外源的刺激信号，调控下丘脑-垂体-性腺轴各水平相关激素合成释放，在维持内分泌系统稳定基础上适时启动发情等一系列内分泌活动导致的结果。促性腺激素释放激素GnRH的脉冲式分泌是激活动物初情期[5]、保证动物繁殖行为及性腺活动、动物由生长转为繁殖的关键。目前，关于动物初情期的启动理论主要有雌激素反馈理论[2,6-7]，即在雌性动物中，雌激素及其受体通过直接或间接作用于下丘脑GnRH神经元调控GnRH合成释放，进而调控整个生殖系统[8-9]。GT1-7细胞能够表现原始GnRH神经元的形态，表达GnRH、KISS-1及GPR54等基因，以及能够脉冲式释放GnRH等功能[10]，广泛应用于体外研究GnRH神经元。截至目前，在NCBI的PubMed数据库利用GT1-7细胞模型研究发表的论文有400余篇。研究表明，GT1-7细胞中外源添加雌激素(100 pmol/L)处理72 h，雌激素能够促进GnRH的节律性分泌[11]。Terasaka等[12]在研究中用100 nmol/L雌激素处理GT1-7细胞，在培养24 h和48 h(P<0.01)时GnRH分泌呈现不同程度的抑制。Otani等[13]则使用nmol/L级不同浓度(1、10以及100 nmol/L)处理GT1-7细胞24 h发现，100 nmol/L雌激素处理显著降低GT1-7细胞GnRH分泌和GnRH 基因表达(P<0.05)，1和10 nmol/L也有抑制GnRH分泌的趋势(P>0.05)。可见雌激素对GnRH分泌的影响会根据处理浓度呈现出不同规律且nmol/L级抑制GnRH分泌而pmol/L级促进GnRH释放。Navarro等[14]将GT1-7暴露在pmol/L级的雌激素条件下5～60 min，表现出剂量依赖性抑制cAMP分泌，而nmol/L级处理60 min可促进cAMP分泌。本实验培养条件下研究发现，1 μmol/L的雌激素处理GT1-7细胞能够抑制GnRH释放，雌激素在处理6 h和12 h时GnRH有一定程度的升高(P>0.05)，在12 h后的GnRH分泌表现出抑制效果，尤其在18 h和30 h达到极显著的抑制效果(P<0.01)，可能与培养条件以及开始处理时雌激素的抑制效果首先表现在基因水平而GnRH蛋白表达较滞后有关。

4.2　雌激素处理对GT1-7细胞GnRH、KISS-1、ERα和GPR54 mRNA表达的影响

研究表明，雌激素对GnRH的分泌有两种反馈调节机制：一是正反馈，即一定水平的雌激素能够促进GnRH的分泌；一是负反馈，即雌激素也能抑制GnRH的分泌[15]。本实验条件下，雌激素处理抑制了GnRH分泌以及GnRHmRNA表达，与GnRH分泌开始出现显著降低的时间(18h)相比，GnRHmRNA在培养6 h即出现显著降低，提示 GnRH分泌的抑制效果首先表达在mRNA表达水平，GnRH分泌滞后于GnRHmRNA表达。表明1 μmol/L的雌激素是通过下调GnRHmRNA表达实现对GnRH分泌的调控。

本实验雌激素处理浓度(1 μmol/L)较Tonsfeldt(100 pmol/L)[11]、Otani(1～100 nmol/L)等[13]的研究中使用的浓度都高，结果表明相较于对照组，处理组ERαmRNA表达极显著降低，提示雌激素通过下调ERα基因表达抑制GnRH分泌，ERα在调控GnRH合成分泌中具有重要作用。研究表明，下丘脑GnRH神经元既表达膜受体(G蛋白偶联雌激素受体，GPER)也表达核受体(雌激素受体ERs)，GnRH神经元能通过GPER直接响应高浓度雌激素而产生负反馈调节作用[16]。提示雌激素处理的效果不仅仅是ERs基因表达变化引起的，膜受体和其他细胞成分也参与了GnRH的调节[17-18]。Otani等[13]发现雌激素能很容易激活蛋白激酶的磷酸化，其中包括细胞外信号调节酶(ERK1/ERK2)以及应激活化蛋白激酶(SAPK/JNK)，但不包括分裂原激活的蛋白激酶(P38MAPK)信号，提示E2参与非基因组效应的调控，雌激素对膜受体和细胞内应答都具有调控作用。

GPR54(G protein-coupled receptor 54)蛋白是KISS-1基因编码的Kisspeptin的受体[19]，Kisspeptin能够促进动物GnRH的释放[20]，通过GPR54发挥生物学活性[21]。研究发现，动物性成熟前后下丘脑KISS-1及GPR54 mRNA表达较幼年期显著增加[22]。给幼年阶段末期的灵长类动物和大鼠持续注射Kisspeptin-10能提前引发和青春期开始时一样的GnRH 分泌[19,23]。可见KISS-1及其受体GPR54在动物初情期启动和生殖上具有不可缺少的作用[24]。本实验研究发现1 μmol/L E2能够抑制GT1-7细胞GPR54和KISS-1 mRNA表达。GPR54 mRNA极显著降低的时间(6、12和24 h)早于且持续时间长于KISS-1 mRNA显著降低的时间(12 h)，表明GPR54 对GnRH分泌减少的响应可能较KISS-1表达产物kisspeptin敏感以及持久。Funes等[25]研究发现GPR54突变小鼠的表型与缺乏性腺类固醇激素小鼠一致，即雌性不能受孕，雄性无法产生精子，可能是GPR54突变导致GnRH分泌异常所致。Kisspeptin能刺激动物促性腺激素的分泌[26]，但Tena-sempere[23]发现kisspeptin对LH释放的影响在敲除GPR54基因的小鼠没有表现，说明Kisspeptin对促性腺激素释放的影响只通过GPR54来调控。Parhar等[27]发现约50%的GnRH神经元都表达GPR54，提示Kisspeptin也可直接作用于GnRH神经元调控GnRH的释放。可见Kisspeptin对GnRH神经元分泌的影响可能是与其受体GPR54结合，引起其他细胞内信使的释放，进而间接调控GnRH释放，也可能是Kisspeptin可通过GPR54直接作用于GnRH神经元。

Kisspeptin对GnRH神经元的调节作用可能部分依赖雌激素活性，100 nmol/L的雌激素和10 nmol/L的Kisspeptin同时处理GT1-7细胞，能够诱导提高GnRH、ERα及ERβmRNA表达[12]。研究表明雌激素与其受体ERα结合调控KISS-1 mRNA的表达，能对GnRH神经元提供更强的刺激信号[28]。提示nmol/L级E2和Kisspeptin在调控GnRH神经元活性上具有协同作用。本实验结果可能的原因是高浓度的雌激素通过抑制ERα表达，下调KISS-1/GPR54系统，进而抑制GnRH合成和分泌。其完整的通路和具体的作用机制还需在此基础上进一步研究。

5　结论

雌激素(1 μmol/L)能够抑制GT1-7细胞脉冲式分泌GnRH，且在18和30 h抑制效果达到极显著。雌激素可能通过影响GnRH、ERα、KISS-1和GPR54的表达调控GT1-7细胞GnRH的合成和分泌，进而调控生殖系统。

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