循环纤维细胞在慢性哮喘模型小鼠气道重塑中的作用

任冬花　关　巍　冯喜英　李西玲　赵　立

(西宁市第二人民医院呼吸科,青海　西宁　810003)

1青海大学附属医院呼吸科

2中国医科大学附属盛京医院第一呼吸与重症监护内科病房

哮喘以气道高反应性、可逆性气流受限和慢性气道炎症为特点〔1〕循环纤维细胞随着其来源、表型转化的特点和在组织损伤修复过程中的作用得到认可，学者们对其研究越来越多〔2～4〕。本文探讨循环纤维细胞在哮喘气道重塑中的作用。

1　材料与方法

1.1材料SPF级健康雌性BALB/c 小鼠30 只，6 周龄，体重(20±3)g，由中国医科大学实验动物中心提供(合格证编号4200592945)。将其随机编号并分为：对照组、哮喘组和氯化钆清空组，每组10只。室内温度18℃～25℃，湿度45%～55%，饲料和应用水均经充分消毒，保证充足食物和水分供应。每日观察小鼠生存状态，及时更换敷料和鼠笼，保证其生存环境卫生。卵原蛋白(OVA)、氯化钆、戊巴比妥钠：美国Sigma 公司；氢氧化铝：上海金赛医药化工有限公司；大鼠抗小鼠CD45 单克隆抗体：美国Biolegend 公司；免疫酶标双标试剂盒购：福州迈新生物技术开发有限公司；多聚赖氨酸：金赛医药化工有限公司；兔抗小鼠Ⅰ型胶原单克隆抗体、兔抗小鼠α-平滑肌肌动蛋白(SMA)单克隆抗体：武汉博士德生物工程有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2实验方法第1、8、15天哮喘组和氯化钆清空组小鼠腹腔内注射氢氧化铝(2 mg)和OVA(20 μg)混悬液，对照组以等量磷酸盐缓冲液(PBS)代替。第21天开始，哮喘组和氯化钆清空组给予50 mg/kg 戊巴比妥麻醉后，经滴鼻吸入0.2%OVA激发小鼠，50 μl/只，每周3次，持续至第52天，共计13次，对照组等量PBS 等时间间隔滴鼻吸入。每次激发前10 min，氯化钆清空组经尾静脉给予氯化钆(2 mg/ml，10 mg/kg，每隔2 d 1次)，对照组和哮喘组用等量的PBS代替，给予时间和方式与氯化钆清空组相同。通过HE染色观察组织形态学变化及图像分析；通过Masson染色观察胶原沉积；通过免疫酶标双标染色法观察气道纤维细胞表面表达。

1.3主要观察指标HE染色观察组织形态学变化及图像分析 将肺组织标本切片置于光学显微镜下，先于100倍下找到视野，后放大到400倍下仔细观察各组小鼠支气管肺组织的基底膜、平滑肌厚度变化及嗜酸性粒细胞浸润和上皮细胞、杯状细胞的改变情况。并在400倍下找到完整的支气管横断面，用HIMAS-2000图像分析软件测量支气管基底膜周径(Pbm)、基底膜面积(Bm)和平滑肌面积(Wam)。Masson 染色观察胶原沉积：光学显微镜下观察并比较各组切片组织中胶原变化情况。参照文献〔5〕，以固定颜色模式界定胶原，色调、饱和度、颜色强度等条件下测定气道壁胶原面积(WAc)，结果以单位长度基底膜的胶原面积(WAc/Pbm，μm2/μm)表示。免疫酶标双标染色法观察气道纤维细胞表面表达：将Ⅰ型胶原和α-SMA表达阳性的细胞质经即用型碱性磷酸酶染色液(BCIP/NBT)染色(阳性显色为蓝黑色)，CD45表达阳性的细胞质经AEC 染色(阳性染色为红色)。染色后的组织切片置于光学显微镜下，先于低倍镜下找到视野，放大到高倍镜后，观察比较CD45、α-SMA和Ⅰ型胶原的表达状况。

1.4统计学方法采用SPSS17.0软件行单因素方差分析、t检验，两个变量间的关系采用线性相关分析。

2　结　果

2.1各组小鼠一般情况表现哮喘组小鼠经致敏和激发两阶段后，出现了不同程度的烦躁不安、易激惹、呼吸急促、喘息等症状；对照组小鼠行动敏捷，未见异常；氯化钆清空组上述表现较哮喘组明显减轻。

2.2各组支气管肺组织病理改变及形态学观察见图1 和表1，哮喘组基底膜、平滑肌层厚度较对照组显著增厚(P<0.05)，氯化钆清空组较哮喘组基底膜、平滑肌厚度显著降低(P<0.05)。

图1　各组肺组织病理学变化(HE，×400)

组别基底膜厚度平滑肌厚度对照组219±0391)617±0691)哮喘组890±0532305±074氯化钆清空组372±0321)886±0541)P值001001

与哮喘组比较：1)P<0.05

2.3各组气道胶原沉积状况见图2，表2，各组Masson染色的结果显示，对照组气道和血管周围少量的胶原沉积或不表达；哮喘组可见气道和血管周围大量的胶原沉积，其中以气道的基底膜为主，肺泡间隔也可见胶原沉积，较对照组明显增多；氯化钆清空组可见气道和血管周围有胶原沉积，肺泡间隔也可见胶原沉积均较对照组增多；但氯化钆清空组的胶原表达量均比哮喘组减少。HIMAS-2000 图像分析结果显示：与对照组〔(6.03±0.17)μm2/μm〕比较，哮喘组〔(31.74±2.08)μm2/μm〕和氯化钆清空组〔(16.02±0.92)μm2/μm〕的胶原表达量明显增加(均P<0.05)；氯化钆清空组的胶原表达量较哮喘组减少，但仍多于对照组(均P<0.05)。

图2　各组肺组织胶原沉积(Masson,×400)

2.4各组气道CD45、α-SMA和Ⅰ型胶原的表达见图3和图4，与对照组气道CD45、Ⅰ型胶原和α-SMA的表达相比，哮喘组和氯化钆清空组的表达明显增加(P<0.01)；其中哮喘组比氯化钆清空组表达增加(均P<0.05)，见表2。

图3　各组气道CD45 和Ⅰ型胶原表达(免疫组化，×400)

图4　各组气道CD45和α-SMA表达(免疫组化，×400)

组别CD45+Ⅰ型胶原CD45+α⁃SMA对照组01372±0033501177±00171哮喘组02290±003221)02273±002361)氯化钆清空组01498±002131)2)01366±001501)2)

与对照组比较：1)P<0.01;与哮喘组比较：2)P<0.05

2.5小鼠气道CD45、α-SMA和Ⅰ型胶原表达水平与基底膜厚度的相关性哮喘组气道组织CD45和Ⅰ型胶原表达与基底膜厚度呈正相关(r=0.86，P<0.01)；CD45和α-SMA表达呈正相关(r=0.95，P<0.01)。氯化钆清空组气道组织CD45和Ⅰ型胶原表达与基底膜厚度呈相关(r=0.96，P<0.01)，氯化钆清空组气道组织CD45和α-SMA表达与基底膜厚度呈正相关(r=0.89，P<0.01)。

3　讨　论

气道重塑的发生机制尚未明确，研究发现哮喘患者支气管上皮下纤维细胞数量较正常人增多，并与支气管基底膜的增厚相关〔6，7〕。本实验发现，哮喘小鼠气道CD45高水平表达，表明气道表达CD45 的细胞可能来源于循环纤维细胞。同样，哮喘小鼠气道Ⅰ型胶原的表达增高和气道中胶原沉积量显著增加，这一方面说明胶原的沉积在气道重塑中起着至关重要的作用；另一方面表明纤维细胞具有相当活跃的生成胶原的能力，提示慢性哮喘气道重塑可能与气道纤维细胞水平有关，与Nihlberg等〔8〕的实验结果一致，相比正常受试者，轻度哮喘患者支气管黏膜及肺泡灌洗液中共同表达CD45、Ⅰ型胶原和α-SMA 的纤维细胞数量增加，这些细胞多聚集在邻近基底膜部位，且黏膜下纤维细胞的数量与基底膜的厚度呈正相关。

氯化钆是循环纤维细胞前体即单核细胞的特异性抑制剂，通过特异性诱导外周血单核细胞的凋亡来特异性抑制其分化〔9,10〕。本实验结果表明运用氯化钆清空循环纤维细胞后，气道重塑得到显著抑制，提示循环纤维细胞在慢性哮喘气道重塑中起着重要的作用〔11,12〕。

然而，本次实验并未提供直接的证据表明，哮喘小鼠支气管黏膜中的纤维细胞是从循环中招募而来的纤维细胞，即气道中的纤维细胞也有可能是来自于气道中固有的未经确认的前体细胞。在分化过程中是否存在中间过渡的细胞亚型如前肌成纤维细胞；循环纤维细胞是直接分化为肌成纤维细胞，还是它刺激了组织中固有间质细胞或者其他前体细胞的增殖分化，这些仍需进一步研究。

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6胥武剑，吴琳，李强，等.肌成纤维细胞在支气管哮喘气道结构重塑中的作用〔J〕.国际呼吸杂志，2011；31(3)：210-3.

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