新疆地方梨品种S基因型的鉴定

张校立，徐叶挺，艾沙江·买买提，许 娟，邓 莉，王继勋

(新疆农业科学院园艺作物研究所/农业部新疆地区果树科学观测试验站，乌鲁木齐　830091)

0　引 言

【研究意义】新疆地方梨品种资源丰富，品种类型独特，具有很多优异基因资源，是我国梨树资源的重要组成部分之一。最著名品种是库尔勒香梨(PyrusbretschneideriRehd)，库尔勒香梨原产新疆库尔勒地区，在新疆已有1 400多年的栽培历史，其果实香味浓郁、皮薄肉脆、清甜爽口、细嫩多汁、耐贮藏性强，是新疆名特优果品之一，截至2016年，库尔勒香梨种植面积达7.38×104hm2(110.83万亩)，产量达128.04×104t[1]。香梨产业已成为库尔勒地区的主导产业。库尔勒香梨自交不亲合，S基因型为S22S28[2]，自交结实率低，需要配置授粉品种，但不同的授粉品种会对香梨果实产生显著的花粉直感效应，突出表现为不同花粉授粉后果实萼片脱落或宿存，萼片脱落后的幼果发育成为 “母梨”，萼片宿存的幼果发育成为“公梨”，二者不但外在品质果形上差异很大，而且内在品质和口感上也差异明显，市场价格差异也非常显著。徐胜利等[3]研究表明，选择新疆梨作为授粉品种能够明显改善香梨果形和果实品质。通过对新疆地方梨品种S-等位基因的鉴定，对库尔勒香梨合理授粉品种的选配和丰产栽培具有重要的理论意义。【前人研究进展】梨自交不亲和性基因的研究始于20世纪50年代，国外最早是Kikuchi, Machida和Terami等[4-6]日本学者，采用广泛的田间授粉杂交实验，从日本沙梨中鉴定了7个S等位基因，命名S1～S7。2000、2001年，Castillo 使用PCR-RFLP系统，发现了S8和S9两个新的S等位基[1]。2006年，Kin等[8]又利用PCR-RFLP在梨品种-Chengsilri.中鉴定出S10-RNase新基因。在西洋中, Zisovich 等[9],Takasaki 等[10]与Mota et等[11],利用特异引物和基因克隆的方法已经鉴定出Sa～St等17个S-RNases基因。2009年，Javier[12]在西洋梨品种‘Abugo’ 和 ‘Ceremeno’两个品种中,鉴定出了一个新的自交亲和的S-allele：S 21，这个基因是由S21的突变体。2014年，Azam Nikzad Gharehaghaji. Kazem Arzani等[13]在57个伊朗的梨品种中鉴定出了3个新的S-RNase，分别是S126、S127 和 S128。中国最早是乌云塔娜[14]在2003年，从中国白梨中分离鉴定了7个新的S基因，分别记S17、S19、S20、S21、S22、S26、S27等位基因；谭晓风等[15]分别从白梨、沙梨及秋子梨等亚洲梨种群分离鉴定了34个S等位基因；从 2003 年开始至今采用 PCR-RFLP、DNA 测序、杂交检测等方法开展了中国梨自交不亲和性的研究，发现了包括 S1～S10基因在内的 42个 S 基因，从中国梨中克隆了 S12、S13、S15、S17～S22、S25～S30、S32、S34、S35、S38～S40、S42、S46等 S 基因全长 cDNA 序列。迄今为止，国内外通过不同的鉴定方法，大概确定了近500 个梨品种的 S 基因型，近500个品种中大部分是白梨系统、秋子梨系统、沙梨系统的品种，新疆梨系统的品种非常少，目前，只有陈慧等[16]鉴定了黄句句(S22S34)、伊犁红句句(S22S28)、早熟句句(S17S19)、乃希木特阿木提(S19S28)沙01号(S22S28)、斯尔克甫梨(S22S28)、墨梨(S26 S b)、贵德长把(S19 S b)等8个新疆梨系统品种S-基因型。【本研究切入点】新疆梨地方品种是我国特有的梨树资源，资源丰富，具有很多优异的基因资源。新疆地方梨品种S基因型的鉴定研究比较少，大部分新疆梨地方梨的S基因型还未鉴定，该研究的9个新疆地方梨品种的基因型目前尚未见报道。研究对新疆地方梨品种S基因型进行鉴定。【拟解决的关键问题】利用PCR和DNA 测序技术鉴定9个新疆地方梨品种的S 基因型。9个品种S 基因型的鉴定，以期丰富我国梨品种 S 基因型信息，为库尔勒香梨筛选最佳的授粉梨品种提供了一定的理论基础，为库尔勒香梨的丰产栽培和遗传改良奠定基础。

1　材料与方法

1.1　材 料

1.1.1新疆地方梨品种

供试品种9个新疆地方梨品种分别为褐色句句梨、轮台句句梨、霍城冬黄梨、八月梨、库尔勒黄酸梨、句句梨、 奎克阿木特1号、可特阿木特和棋盘梨。品种均来自新疆农业科学院轮台国家果树资源圃。于2017年4月上旬采集各品种幼嫩叶片置于液氮中，带回实验室后于-80 ℃ 冷冻保存。

1.1.2试剂

ExTaq、pMD18-T Vector、DNA回收试剂盒购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司，DNA 提取试剂盒购于天根科技生化化有限公司，其他药品均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2　方 法

1.2.1基因组 DNA 提取

参照植物基因组 DNA 提取试剂盒说明书(柱式植物DNAout2．0，天根科技生化化有限公司) 提取梨基因组 DNA，在1%琼脂糖凝胶、1×TAE缓冲液、3～5 V/cm 下电泳，电泳结果用上海复日 FR-980 凝胶图成像系统照相，检测 DNA 样品。

1.2.2PCR 扩增及检测

根据已报道梨的S基因相关信息, 获知梨S基因的一级结构由5个保守区、1个高频可变区及1个内含子组成。高频可变区是花粉识别的部位。S基因多态性主要源于高频可变区的差异, 通常根据高频可变区的差别判断不同的S基因。因此，根据 S 基因一级结构特点，利用 S 基因高变区( hypervariable region，HV) 的保守序列设计合成引物。

正向引物 PF：(5'-TTTACGCAGCAATATCAG-3')

反向引物 PR：( 5'-AC( A / G) TTCGGCCAAATAATT-3')

在江南等[17]扩增反应体系及反应过程的基础上略作调整，使用ExTaq酶保证扩增结果的可靠性，扩增产物在 1.4% 琼脂糖凝胶上于100 V电泳30～45 min，上海复日FR-980凝胶图像系统分析拍照并记录分析。

1.2.3PCR 产物回收、克隆、测序

利用凝胶回收试剂盒回收目的 DNA 片段，与 PEASY-T5载体16℃ 条件下过夜连接，连接产物转化至感受态大肠杆菌Trans1-T1，涂于 SOC/Amp50 固体培养基上 37℃ 过夜。挑选阳性克隆，菌液 PCR 筛选带有目的片段长度的克隆 。每个 S 基因片段挑选 3 个阳性克隆，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果利用Blast 与 GenBank 中已知的 S-RNase 基因序列比较，确定其S基因型。

2　结果与分析

2.1　新疆梨地方梨品种基因组 DNA 提取

利用北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司生产的 DNA 提取试剂盒，提取新疆梨地方梨品种的基因组 DNA，经琼脂糖电泳检测，具有提取浓度高、纯度好，蛋白质、RNA 杂质含量少特点，通过稀释可以直接用于 PCR扩增。图1

注：M. Markers、1.褐色句句梨；2、轮台句句梨；3.霍城冬黄梨；4.八月梨；5.库尔勒黄酸梨；6.句句梨；7. 奎克阿木特1号；8.可特阿木特；9. 棋盘梨

Note: M.Markers;1.Hesejujuli;2.Luntaijujuli;3.Huochengdonghuali;4.Bayueli;5.Kuerle- huangsuanli; 6. Jujuli;7.Kuikeamute1hao;8.Keteamute;9.Qipanli

图19个新疆地方梨品种基因组DNA琼脂糖电泳检测结果
Fig.1The agarose electrophresis result of DNA extracted from nine local pear cultivars in Xinjiang

2.2　新疆梨地方梨品种PCR 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离

使用S-allele特异性引物PF和PR将对新疆地方梨品种的基因组 DNA 进行 PCR 扩增，扩增产物进一步聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，由于PCR 产物在聚丙烯酰胺凝胶上电泳随迁移率的不同, 表现为不同位置的条带。研究表明，除奎克阿木特1号表现出明显的3条明显的条带外，褐色句句梨、轮台句句梨、霍城冬黄梨等8个品种在聚丙烯酰胺凝胶上均呈现2条明显的条带。褐色句句梨、轮台句句梨、霍城冬黄梨、八月梨等8个品种的两条带都在300～500 bp，奎克阿木特1号的两个条带在300～500 bp，另外一条带在600～800 bp。褐色句句梨、轮台句句梨、八月梨、句句梨的两个扩增条带和奎克阿木特1号的其中两个扩增条带在聚丙烯酰胺凝胶上的位置相同,其S基因碱基序列是否相同有待进一步分析。图2

2.3　新疆梨地方梨品种S基因型的鉴定

聚丙烯酰胺凝胶电泳后回收目的条带、克隆后，将克隆后的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，将测定的结果序列使用生物信息学软件进行 Blast 搜索、同源性比较, 根据分析GenBank内 S 基因的碱基序列及同源性,确定9个新疆地方梨品种的 S 基因型。7个品种中 S 基因的核苷酸序列与 GenBank 中已登录的梨 S 基因有极高的同源相似性，褐色句句梨的S基因与S28、S4基因的相似性达98%、99%；轮台句句梨的S基因与S28、S4基因的相似性均为100%，霍城冬黄梨的S基因与S28、S4基因的相似性达100%、99%；八月梨S基因与S28，S4基因的相似性达99%、100%；库尔勒黄酸梨的S基因与S22、S35基因的相似性达100%、100%；奎克阿木特1号的S基因与S36、S34、S22基因的相似性达100%、98%、100%；可特阿木特一个S基因与S8相似性达100%，另外，一个没有鉴定出来，棋盘梨一个S基因与S28相似性达99%，另外，一个也没有鉴定出来。表1

注：M. Markers、1.褐色句句梨、2、轮台句句梨、3.霍城冬黄梨、4.八月梨、5.库尔勒黄酸梨、6.句句梨、7. 奎克阿木特1号、8.可特阿木特、9. 棋盘梨

M.Markers;1.Hesejujuli;2.Luntaijujuli;3.Huochengdonghuali;4.Bayueli;5.Kuerle- huangsuanli; 6. Jujuli;7.Kuikeamute1hao;8.Keteamute;9.Qipanli

图29个新疆梨地方梨品种S 基因特异扩增的 6% 聚丙烯酰胺凝胶电泳
Fig.2The 6% PAGE of PCR amplification of genomic DNA with S gene specific primers on the nine local pear cultivars in Xinjiang表19个新疆地方梨品种的S基因型
Table1S-genotypes of nine local pear cultivars in Xinjiang

序号No．品种Cultivars系统System引物PrimersPCR片段长度ThePCRfragmentsize(bp)S基因型S-genotype1褐色句句梨新疆梨PF/PR428/374S28S42轮台句句梨新疆梨PF/PR428/374S28S43霍城冬黄梨新疆梨PF/PR428/371S28S44八月梨新疆梨PF/PR428/347S28S45库尔勒黄酸梨新疆梨PF/PR346/378S22S356句句梨新疆梨PF/PR428/374S28S47奎克阿木特1号新疆梨PF/PR568/342/428S36S34S228可特阿木特新疆梨PF/PR440/xS8Sx9棋盘梨新疆梨PF/PR428/xS28Sx

3　讨 论

研究应用 PCR和DNA测序技术对 S 基因特异性扩增条带的测序, 然后通过 blast生物信息软件对测序的DNA序列进行分析，由于可特阿木特和棋盘梨各鉴定出一条基因，9个新疆地方梨品中只能明确确定了 7个品种 S基因型，结果为：褐色句句梨 S28S4、轮台句句梨S28S4、霍城冬黄梨S28S4、八月梨S28S4、库尔勒黄酸梨S22S35、句句梨S28S4、奎克阿木特1号S36S34S22；可特阿木特和棋盘梨S基因型暂定为S8Sx和 S28Sx。同为新疆地方梨品种，它们之间既有相同之处，也有不同之处，比如：褐色句句梨、轮台句句梨，霍城冬黄梨、八月梨、句句梨等5个品种具有相同的基因型S28S4，它们5个品种间不能相互作授粉品种，因为它们具有相同的基因型，如果相互间作授粉品种，就会出现不结果或结果率极低；库尔勒黄酸梨和奎克阿木特1号2个品种的基因型不相同，它们三个品种间可以相互作授粉品种。由于可特阿木特和棋盘梨只鉴定出一个S基因，没有明确确定出其S基因型，因此，可特阿木特和棋盘梨与其它品种间的授粉情况暂不能下定论。这9个新疆地方梨品种中除可特阿木特外，其它8个品种都含有库尔勒香梨的S基因，色句句梨、轮台句句梨，霍城冬黄梨、八月梨、句句梨、棋盘梨等6个品种含有库尔勒香梨的S28，库尔勒黄酸梨和奎克阿木特1号含有库尔勒香梨的S22基因，除可特阿木特外，其它8个新疆地方梨品种都不适宜作库尔勒香梨的授粉品种。

在起源上，8个新疆地方梨品种既然都含有库尔勒香梨的S基因，说明这 8个品种与库尔勒香梨在起源上有很大的相关性。另外，鉴定出的9个新疆地方梨品种的分别含有S4、S8、S22、S28、S34、S35、S36等S基因，这些基因分别属于白梨系统、沙梨系统和西洋梨系统的S基因，初步推论新疆地方梨品种可能是白梨系统、沙梨系统和西洋梨系统的杂种，杂种后代又经过长期的自然杂交，互相演化而来成现在的品种，这个推论结果与沈德绪、藤元文等[18，19]的研究结果大致是相同的；在果树育种学上，沈德绪等[18]认为新疆梨可能是西洋梨与白梨的杂交种；藤元文等[19,20]认为新疆梨遗传组成至少包括了白梨或砂梨，西洋梨和杏叶梨，可能是这几个种的自然杂交种，另外，他们利用DNA标记研究表明原产新疆的所谓杏叶梨属于西方梨类型；但是，马兵刚等[20]试验结果RAPD 数据对新疆梨是否为西洋梨和白梨的杂交种无法判断。新疆地方梨品种尤其是库尔勒香梨具体的起源与分类还需进一步深入的研究与分析，这对库尔勒香梨的品种改良及丰产栽培具有重要的指导价值。

4　结 论

通过PCR和DNA测序技术鉴定了9个新疆地方梨品中的S基因型，确定了7个新疆地方梨品种S基因型，鉴定的结果为：褐色句句梨 S28S4、轮台句句梨S28S4、霍城冬黄梨S28S1、八月梨S28S4、库尔勒黄酸梨S22S35、句句梨S28S4、奎克阿木特1号S36S34S22；新疆地方梨品S-genotype的鉴定，增加我国7个新疆地方梨品种的S-genotype信息，为新疆地方梨品种尤其是库尔勒香梨起源与分类提供了一定的理论支持，为库尔勒香梨的的丰产栽培和品种改良提供了指导依据，为库尔勒香梨授粉品种的筛选新疆地方梨品种提供理论依据。

参考文献(References)

[1] 新疆维吾尔自治区统计局.新疆统计年鉴[J].北京:中国统计出版社,2017:383.

Statistics Bureau of Xinjiang Uyghur Autonomous Region (2017).XinjiangStatisticalYearbook[J]. Beijing: China Statistics Press:383.(in Chinese).

[2]吕文娟,冯建荣,刘小芳,等. '库尔勒香梨'自交不亲和S-RNase等位基因全长的克隆与分析[J]. 分子植物育种,2017,15(5):1 639-1 647.

LÜ Wen-juan, FENG Jian-rong, LIU Xiao-fang et al. (2017). Cloning and Analysis of Self-incompatibility S-RNase allelic Genes in Korla Fragrant Pear [J].MolecularPlantBreeding, 15(5):1,639-1,647. (in Chinese)

[3]徐胜利,陈小青,徐崇志,等.新疆梨系统品种花粉直感对香梨果萼发育及品质的影响[J].山西果树,2014,(5):3-6.

XU Sheng-li, CHEN Xiao-qing, XU Chong-zhi et al. (2014). The xenia ofP.sinkiangensisYu cultivars effects on Fruit calyx growth and quality [J].ShanxiFruits, (5):3-6. (in Chinese)

[4]Kikuchi A (1929). Investigations in 1927 and 1928. 1. Paterclinical incompatibility in the Japanese pear Okistse Hort Soc, 24:1-6. (in Japanese).

[5]Machida, Y. (1982). S genotype of several cultivars of japanese pear and doubts about the parents of 'Housui'.Abstr.japan.soc.hort.sci.autumnMeet. (in Japanese)

[6]Terami, H. (1946). Analysis of the sterility factors existing in varieties of the japanese pear (pyrus serotina rehd. var. culta rehd.).StudiesHort.inst.kyotoImp.univ, (3):267-271. (in Japanese)

[7]Castillo, C., Takasaki, T., Saito, T., Norioka, S., & Nakanishi, T. (2002). Cloning of the S8-rnase (S8-allele) of Japanese pear (pyrus pyrifolia nakai).PlantBiotechnology, 19(1): 1-6.

[8]Kim, H. T., Hirata, Y., Kim, H. J., & Nou, I. S. (2006). The presence of a new s-rnase allele (s 10 ) in asian pear ( pyrus pyrifolia, (burm; nakai)).GeneticResources&CropEvolution, 53(7): 13,755-13,83.

[9]Zisovich, A., Stern, R., Shafir, S., & Goldway, M. (2004). Identification of seven s-alleles from the european pear (pyrus communis) and the determination of compatibility among cultivars.JournalofPomology&HorticulturalScience, 79(1): 101-106.

[10]Takasaki, T., Moriya, Y., Okada, K., Yamamoto, K., Iwanami, H., & Bessho, H., et al. (2006). Cdna cloning of nine s alleles and establishment of a pcr-rflp system for genotyping European pear cultivars.Theoretical&AppliedGenetics, 112(8): 1,543-1,552.

[11]Mota, M., Tavares, L., & Oliveira, C. M. (2007). Identification of s -alleles in pear ( pyrus communis, l.) cv. 'rocha' and other european cultivars.ScientiaHorticulturae, 113(1): 13-19.

[12]Sanzol, J. (2009). Pistil-function breakdown in a new -allele of european pear, confers self-compatibility.PlantCellReports, 28(3): 457-467.

[13]Gharehaghaji, A. N., Arzani, K., Abdollahi, H., Shojaeiyan, A., Dondini, L., & Franceschi, P. D. (2014). Genomic characterization of self-incompatibility ribonucleases in the Central Asian pear germplasm and introgression of new alleles from other species of the genus pyrus.TreeGenetics&Genomes, 10(2): 411-428.

[14]乌云塔娜.中国白梨自交不亲和基因的分离鉴定[D]. 长沙: 中南林学院博士论文,2003.

Wuyuntana. (2003).Isolationandidentificationofself-incompatiblegenesofChinesepyrusebretschneideri[D].PhD Dissertation. The Central-South Forestry University, Changsha.

[15]Tan, X. F., Zhang, L., Wuyun, T. N., Yuan, D. Y., Cao, Y. F., & Jiang, A. F., et al. (2007). Molecular identification of two new self-incompatible alleles (s-alleles) in chinese pear (pyrus bretschneideri).JournalofPlantPhysiology&MolecularBiology, 33(1): 61-70.

[16]陈慧,张树军,张绍铃,等.40个梨品种S基因型的鉴定及S基因频率分析[J].南京农业大学学报, 2013，36(5):21-26.

CHEN Hui, ZHANG Shu-jun, ZHANG Shao-ling, et al. (2013). Identification of S-genotypes in forty pear cultivars and analysis of S-RNase genes frequency in Pyrus [J].JournalofNanjingAgriculturalUniversity, 36(5):21-26. (in Chinese)

[17]江南, 张琳, 谭晓风,等. 基于 cDNA 芯片的梨品种 S 基因型鉴定及新 S-RNase 基因进化分析[J].植物遗传资源学报, 2017,18(3): 520-529.

JIANG Nan, ZHANG Lin, TAN Xiao-feng, et al. (2017). Detection of Pear S-genotypes and Evolutionary Analysis of Novel S-RNase Genes Identified by cDNA Microarray-based Method [J].JournalofPlantGeneticResources, 18(3): 520-529. (in Chinese)

[18]沈德绪.果树育种学[M].北京:中国农业出版社,1995:175.

SHENG De-su.(1995).Fruittreethremmatology[M]. Beijing: China Agriculture Press: 175. (in Chinese)

[19]滕元文,柴明良,李秀根.梨属植物分类的历史回顾及新进展[J].果树学报,2004,(3):252-257.

TENG Yuan-wen, CHAI Ming-liang, LI Xiu-gen. (2004). A Historic Retrospect and the Progress in the Taxonomy of the Genus pyrus.[J].JournalofFruitScience, (3):252-257. (in Chinese)

[20]Teng, Y. Y., Tanabe, K., Tamura, F., & Itai, A. (2001). Genetic relationships of pear cultivars in xinjiang, china, as measured by rapd markers.JournalofHorticulturalScience&Biotechnology, 76(76):771-779.

[21]马兵钢,牛建新,吴忠华,等.新疆主要梨品种亲缘关系的分子标记分析[J].石河子大学学报(自然科学版),2004,(2):97-102.

MA Bing-gang, NIU Jian-xin, WU Zhong-hua, et al. (2004). Molecular Markers Analysis of Main Cultivars Relationship between Pyrus in Xinjiang [J].JournalofShiheziUniversity(NaturalScience) , (2):97-102. (in Chinese)