痛泻安肠方对腹泻型肠易激综合征模型大鼠结肠TRPV1表达及血浆SP、CGRP含量的影响

韩亚飞 ，王允亮，郭 一，石 磊，贾博宜，李军祥*

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院消化内科，北京100078）

腹泻型肠易激综合征（IBS-D）是临床上常见的功能性胃肠道疾病，以反复发作的腹痛、腹泻为主要表现，同时可伴有腹胀或腹部膨胀的症状[1]。目前，IBS-D的发病机制尚未明确。本研究通过观察痛泻安肠方对IBS-D大鼠结肠TRPV1和血清SP、CGRP的影响，初步探讨痛泻安肠方治疗IBS-D的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性SD大鼠60只，SPF级，体质量（120±20）g，由斯贝福(北京)实验动物科技有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2016-0002，饲养在北京中医药大学东方医院动物中心。实验全程牢牢遵守动物福利的指导准则，即以减少（Reduction）、替代（Replacement）和优化（Refinement）为核心的“3R”原则。

1.2 试剂 痛泻安肠方水煎剂（炒白术15 g，炮姜9 g，炒白芍12 g，乌梅9 g，蜘蛛香6 g，黄连6 g，蝉蜕6 g，0.5 g生药/mL）购自北京中医药大学东方医院中药房，匹维溴铵片（得舒特，法国苏威特，批号：H20070059）购自北京中医药大学东方医院药房。乙酸、液体石蜡（北京化学试剂公司）；MEDEX中心静脉导管（单腔）（美国）；实时荧光定量试剂盒（ 宝生物公司）；总RNA提取试剂、RIPA总蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒（Sigma公司）；GAPDH鼠单抗、山羊抗兔IgG（H+L）/ HRP（Jackson公司）；SP ELISA Kit、CGRP ELISA Kit（武汉华美公司）；MultiSkan3酶标仪（美国Thermo公司）、ABI7500荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）。

1.3 方法

1.3.1 分组与造模 制备模型前运用随机数字表法将大鼠分为空白组、模型组、痛泻安肠方高剂量组（按正常人用标准计量2倍换算）、痛泻安肠方中剂量组（按正常人用标准计量换算）、痛泻安肠方低剂量组（按正常人用标准计量1/2倍换算）和匹维溴铵组，每组10只。参照AL-Chaer ED[2]的造模方法，将大鼠倒置，用石蜡将中心静脉导管润滑，将0.5% 的冰醋酸经肛门插入距肛缘3～5 cm处，灌注量从0.2 mL开始，逐渐增加至0.7 mL，持续2周。用石蜡将双腔导尿管球囊端润滑，经肛门插入距肛缘2～3 cm处，向球囊中充气1.5～2.0 mL/次，以大鼠出现腹部收缩为度，共扩张3次，同时给予夹尾刺激，持续时间3～5 min，持续2周。在冰醋酸灌肠、球囊直肠刺激联合夹尾刺激的同时予番泻叶浓缩剂（0.5 g/mL）灌胃，给药体积为20 mL/（kg·d），持续4周。

1.3.2 标本采集 末次给药后，将大鼠禁食禁水24 h，用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，抽取大鼠腹主动脉血，静置后分离血清，分装- 80 ℃保存。取距离大鼠肛门约8 cm处的结肠组织，放入冻存管内，经生理盐水冲洗干净后置于液氮内冻存，之后放入到- 80 ℃冰箱备用。

1.4 指标检测

1.4.1 内脏敏感性评价 腹壁撤退反射（AWR）评分检测大鼠内脏敏感性。AWR评分标准[3]：0分，结直肠扩张刺激时大鼠情绪基本稳定；1分，给予刺激时变得开始不稳定，偶尔扭动头部；2分，给予刺激时腹背部肌肉轻微收缩但腹部未抬离地面；3分，刺激时腹背部肌肉较强烈收缩并出现腹部抬离地面的情况；4分，腹部肌肉强烈收缩，腹部呈弓形，并把腹部、会阴部抬离地面。

1.4.2 粪便 Bristol分级评分 粪便 Bristol分级评分检测大鼠的腹泻情况。粪便 Bristol分级评分标准[4]：1型：分散的硬块，如坚果；2型：腊肠状，成块的；3型：腊肠状，表面有裂缝；4型：腊肠状或蛇状，光滑而柔软；5型： 柔软团块，边缘清楚；6型：绒状便，边缘不清，或糊状粪；7型：水样粪，无固状物。

1.4.3 结肠TRPV1和TRPV1 mRNA的检测 采用Western blot检测TRPV1的表达。提取蛋白，预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入BSA标准液，检测样品蛋白含量；以RIPA调整蛋白浓度，分别加入一抗、二抗，洗膜后进行凝胶图像分析，得出数值。采用Real-TimePCR检测TRPV1 mRNA的表达。进行引物设计，提取组织样本RNA，测定RNA浓度和纯度，逆转录合成cDNA后再进行PCR扩增，以2-△△ct作为目地基因对数据进行相对定量分析。

1.4.4 血清SP、CGRP的检测 Elisa测定血清SP和CGRP的表达。将试剂盒平衡至室温，按试剂盒说明书稀释标准品，加样后用洗涤液洗涤4次并拍干，加入HRP标记的二抗，依次加入显色剂A和B，37 ℃避光反应15～30 min，加入50 μL终止液，450 nm波长下读取吸光值。

1.5 统计学方法 采用IBM SPSS Statistics 22.0进行统计，计量资料采用均数±标准差（）的形式表示，对符合正态分布且方差齐的数据，其组间差异采用单因素方差分析，不服从正态分布或方差不齐的数据采用非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 内脏敏感性评价 见表1。

表1 治疗前后各组大鼠AWR评分比较（，n = 10） 分

表1 治疗前后各组大鼠AWR评分比较（，n = 10） 分

注：与空白组比较，# P＜0.05，## P＜0.01；与模型组比较，△ P＜0.05，△△ P＜0.01

组 别 治疗前治疗后1.0 mL 1.5 mL 2.0 mL 1.0 mL 1.5 mL 2.0 mL空白组 0.75±0.27 1.72±0.68 2.95±0.60 0.80±0.19 1.83±0.19 2.92±0.34模型组 1.38±0.61 2.88±0.58## 3.48±0.50 1.33±0.43# 2.92±0.24△△ 3.45±0.45#低剂量组 1.47±0.50# 2.92±0.80## 3.62±0.45# 0.85±0.36△ 2.05±0.39△△ 2.98±0.34△中剂量组 1.50±0.70# 2.55±0.61# 3.38±0.53 1.00±0.34 1.88±0.27△△ 2.95±0.36△高剂量组 1.28±0.51 2.67±0.55# 3.42±0.61 0.90±0.36△ 2.00±0.34△△ 3.08±0.27得舒特组 1.45±0.70# 2.87±0.47## 3.50±0.58 0.93±0.33 2.12±0.55△△ 3.05±0.36

2.2 粪便 Bristol分级评分 见表2。

表2 大鼠粪便Bristol分级评分比较（，n = 10）分

表2 大鼠粪便Bristol分级评分比较（，n = 10）分

注：与空白组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01

组 别 第28天 第42天空白组 4.58±0.38 4.42±0.38模型组 6.25±0.27## 6.34±0.41##低剂量组 6.33±0.41## 4.50±0.45△△中剂量组 6.17±0.26## 4.75±0.27△△高剂量组 6.17±0.52## 4.58±0.58△△得舒特组 6.42±0.38## 4.67±0.75△△

2.3 结肠TRPV1蛋白和TRPV1 mRNA表达检测结果 见表3。

表3 大鼠结肠TRPV1蛋白表达灰度值及TRPV1 mRNA的比较 （，n = 6）

表3 大鼠结肠TRPV1蛋白表达灰度值及TRPV1 mRNA的比较 （，n = 6）

注：与空白组比较，# P＜0.05，## P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01

组 别 TRPV1/GAPDH TRPV1/2-△△ct空白组 0.98±0.52 1.26±0.26模型组 2.51±0.42# 2.17±0.60##低剂量组 0.61±0.52△△ 1.33±0.15△△中剂量组 0.90±0.82△△ 1.20±0.37△△高剂量组 1.95±0.41 0.90±0.13△△得舒特组 1.96±0.16 1.35±0.15△△

2.4 血清指标的检测结果 见表4。

表4 各组大鼠血清SP、CGRP的表达比较（，n = 10）

表4 各组大鼠血清SP、CGRP的表达比较（，n = 10）

注：与空白组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△ P＜0.05，△△ P＜0.01

组 别 SP CGRP空白组 97.69±8.61 12.31±1.37模型组 124.19±8.06## 14.98±1.67##低剂量组 100.55±10.31△△ 13.03±1.47△中剂量组 97.77±7.32△△ 13.13±0.80△高剂量组 95.73±9.33△△ 12.55±1.83△△得舒特组 101.99±6.55△△ 13.93±1.54△

3 讨论

瞬时受体电位香草酸亚型-1（TRPV1）是一种产生痛觉过敏和病理性疼痛伤害性感受分子，在IBS内脏高敏感性发生中具有关键作用[5]。研究[6-7]证实，内脏敏感性增加是本病发病的关键因素；TRPV1在 IBS患者乙状结肠的表达较正常人更高，并与患者的腹痛严重程度呈正相关。亦有研究[8]发现，感觉神经元TRPV1表达上调与内脏高敏感性疼痛的发生密切相关，是启动并保持胃肠道高敏感性的重要分子。TRPV1基因敲除可以降低胃肠道传入神经在扩张刺激下的机械敏感性[9]。SP和CGRP作为感觉神经传递介质，广泛分布于外周以及中枢神经系统。SP 能通过强烈刺激消化道平滑肌，增强胃肠蠕动，产生腹痛或腹部不适症状[10]。研究[11]发现，IBS大鼠血浆中SP含量明显升高，肠道痛阈降低从而出现肠道过敏。CGRP能够调节胃肠分泌和运动功能，加快结肠的蠕动，导致腹痛、肠鸣及腹泻等临床症状[12]。研究[13]显示，血浆CGRP水平在IBS 发病中发挥着重要作用，提示CGRP的升高与内脏高敏感性密切相关。

痛泻安肠方是导师李军祥教授经过多年临床总结的临床经验方，在IBS-D的治疗中取得了显著的疗效。方中白术苦甘而温，补脾燥湿以治土虚，为君药；炮姜性温，善暖脾胃，能温中止痛止泻，与白术共为君药。白芍酸寒，柔肝缓急止痛，与白术相配，收健脾止泻之功；味酸入肝，与白芍相配则加强柔肝止痛之力，与白芍共为臣药。蜘蛛香辛苦而温，理气中泻木；乌梅酸涩性平，能涩肠止泻，与白术相配以止痛，除湿止泻；黄连清热燥湿，厚肠止泻；蝉蜕气味甘寒，乃清虚之品，能祛风而胜湿，与黄连相配，防止湿邪入里化热，与蜘蛛香、黄连共为佐药。诸药相伍，是仿痛泻要方之义，使脾健肝舒，气机调畅，痛泻自止[14]。

本研究显示，IBS-D大鼠内脏敏感性阈值下降，粪便含水量和粪便Bristol分级评分均明显升高，结肠组织TRPV1蛋白表达升高，结肠TRPV1 mRNA表达升高，血清SP、CGRP水平升高；痛泻安肠方治疗后内脏敏感性阈值升高，大鼠粪便含水量和粪便Bristol分级评分降低，且接近空白组，结肠组织TRPV1蛋白表达下降， TRPV1 mRNA表达降低，血清SP、CGRP水平下降，说明痛泻安肠方能上调内脏敏感性阈值，下调结肠组织TRPV1蛋白表达，降低结肠TRPV1 mRNA的表达，降低血清SP、CGRP水平，达到治疗IBS-D的目的。

但是，实验结果显示，高剂量组和得舒特组大鼠结肠组织中TRPV1蛋白和TRPV1 mRNA的表达并不完全一致，其中TRPV1蛋白在治疗前后并未发生明显改变，肠道功能的变化是否主要体现在蛋白的表达上以及基因是否参与肠道功能的变化仍需进一步验证，TRPV1蛋白的表达是否与和TRPV1 mRNA的表达同步尚需进一步研究。

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