15 种中药水煎法与乙醇回流提取法体外抑菌试验比较

南苹瑶, 蔡紫璇, 周思嘉, 杨 胜, 吴小雪, 王小莺

(江西农业大学动物科技学院 江西农业大学兽药研究所, 江西 南昌330045)

中药属于天然药物,具有不易产生耐药性、毒副作用小和在畜禽体内药物蓄积量低等优势,因此,用中药来预防和治疗细菌性疾病已成为近些年来的热点。 目前,已经有很多关于中药抑菌方面的研究,并且已经筛选出许多具有抑菌作用的中药及有效成分[1～4]。 本试验研究了醋五味子、石榴皮、千里光、地榆、忍冬花等15 种中药的水煎提取液和乙醇回流提取液对大肠杆菌的抑菌作用,以便为中药抗大肠杆菌的发展和应用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 药材：选用醋五味子、千里光、石榴皮、地榆、石菖蒲、吴茱萸、秦皮、姜厚朴、白头翁、升麻、忍冬花、马齿苋、葛根、大青叶、鱼腥草15 种中药,均购自南昌市下罗益丰大药房。

菌种：大肠埃希菌ATCC25922,购自广东省微生物菌种保藏中心。

仪器与设备：粉碎机(DFT-100,温岭市林大机械有限公司);旋转蒸发器(RE5298A,上海亚荣生化仪器厂);循环水式真空泵(SHZ-DⅢ巩义市予华仪器有限责任公司);立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-50KBS,上海申安医疗器械厂);双人单面净化工作台(SW-CJ-2D,苏州净化设备有限公司);生化培养箱(韶关市泰宏医疗器械有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备 麦康凯琼脂培养基：取麦康凯琼脂粉末12.5 g,加入装有250 mL 蒸馏水的锥形瓶中,加热煮沸溶解并搅拌,121 ℃高温灭菌20 min后备用。 未冷却凝固时分别倒入12 个灭菌干燥的培养皿中,等待琼脂冷却凝固。 冷却后4 ℃冷藏备用。

MH 肉汤培养液：MH 肉汤粉末7.5 g,加入装有250 mL 蒸馏水的锥形瓶中加热煮沸溶解并搅拌,121 ℃高温灭菌20 min 后备用。 冷却后4 ℃冷藏备用。

1.2.2 菌液的制备 取冷冻保存的塑料冻存管,立即放置在38 ℃～40 ℃水浴中快速复苏并适当摇动。 直到内部结冰完全溶解为止,一般约50 ～100 s,开启塑料冻存管,吸取菌液移植于麦康凯琼脂培养基上,37 ℃恒温培养18 ～24 h。 挑取该麦康凯琼脂培养基上的单个菌落接种至另一麦康凯琼脂培养基上进行菌种复苏。 采用麦氏比浊法进行细菌计数,勾取平板上菌落1 ～2 个,置于MH 肉汤中,37 ℃恒温振荡培养至对数生长期后进行细菌计数。 菌液4 ℃冰箱保存备用,临用前稀释为106CFU/mL。

1.2.3 中药提取物的制备

1.2.3.1 水煎法 分别称取所选的15 种中药粉末4 g,用滤纸包好,1 ∶20 的料液比用蒸馏水浸泡30 min后,加入500 mL 圆底烧瓶内塞上瓶口加热煎煮两次,每次30 min,收集两次提取液,浓缩至膏状物,用蒸馏水以1 g/mL 生药浓度溶解膏状物,过滤除菌,4 ℃冰箱冷藏备用。

1.2.3.2 乙醇回流提取法 分别称取所选的15 种中药粉末4 g,用滤纸包好,1∶20 的料液比用70%乙醇浸泡30 min 后,加入500 mL 圆底烧瓶内回流提取两次,每次30 min,收集两次提取液,浓缩至膏状物,分别用70%乙醇以1 g/mL 生药浓度溶解,过滤除菌,4 ℃冰箱冷藏备用。

1.2.4 体外抑菌试验 根据凤尾草乙醇提取物体外抑菌试验的筛选的结果[5],试管二倍稀释法中溶剂乙醇对大肠杆菌的MIC 值为6.25%,琼脂打洞法测定不同浓度梯度的乙醇溶液对大肠杆菌均无抑菌作用,说明在研究中药提取物的体外抑菌试验中,用70%乙醇溶解提取物在琼脂打洞法试验中不会对结果造成影响。 因此,为了减少操作,省去以无水乙醇作为对照,选用琼脂打洞法做体外抑菌试验,拿灭菌棉签将制备好的菌液均匀地涂抹在麦康凯琼脂平板上,室温干燥5 min,无菌打孔器打孔,以无孔针头小心挑出孔内琼脂,滴少量未凝固的琼脂于孔内封底,防止药液从孔内流出。 每个孔滴加药液100 μL,重复3 次,放置30 min 后,37 ℃培养箱中培养18 ～24 h 后观察抑菌圈大小,取得平均值并记录。

1.3 结果判定标准 打孔法：抑菌圈直径＜10 mm为低敏;抑菌圈直径在10 ～14 mm 为中敏;抑菌圈直径在15 ～19 mm 为高敏;抑菌圈直径≧20 mm 为极敏,无抑菌圈为不敏感[6]。

2 结果与分析

2.1 水煎法提取中药体外抑菌试验 地榆、千里光、忍冬花、石榴皮、醋五味子水煎法提取物对大肠杆菌均有抑制作用,所测得平均抑菌圈大小分别为7.33 mm、10.67 mm、8.83 mm、6.5 mm、16.17 mm。其中醋五味子对大肠杆菌的抑菌效果最好,为高度敏感,千里光次之,为低度敏感。 其他中药提取物对大肠杆菌均无抑制作用,根据判定标准表现为不敏感。 结果见表1 及图1。

表1 水煎法及乙醇回流法提取中药体外抑菌试验结果

2.2 乙醇回流法提取中药体外抑菌试验 70%乙醇回流提取中药有效成分对大肠杆菌的抑制作用有所不同,同样的15 种中药中醋五味子、石榴皮、大青叶和千里光有抑制作用,所测得的平均抑菌圈直径分别为24.33 mm、11.67 mm、8.33 mm和6.67 mm,其余中药提取物对大肠杆菌表现为不敏感。 醋五味子的抑菌作用最强,为极度敏感;石榴皮的抑菌作用为中度敏感;大青叶和千里光的抑菌作用较弱,为低度敏感。 结果见表1 及图2。

图1 各中药水煎法提取物对大肠杆菌的体外抑菌结果

图2 各中药乙醇回流法提取物对大肠杆菌的抗菌的体外抑菌结果

在本试验中,15 种中药分别采用水煎法和乙醇回流法进行提取,提取物对大肠杆菌呈现不同程度的抑菌活性。 除醋五味子和石榴皮在两种提取方法下对大肠杆菌都表现有抑菌作用外,其余具有抑菌作用的中药都不同,且醋五味子和石榴皮的乙醇回流提取物对大肠杆菌的平均抑菌圈大小分别为24.33 mm、11.67 mm,而它们的水煎法提取物对大肠杆菌的平均抑菌圈大小分别16.17 mm、6.5 mm,乙醇回流法提取中药的抑菌效果明显优于水煎法。

3 讨论

不同中药的不同提取方法对于大肠杆菌的抑制作用具有差异性,而且对于相同的中药通过不同的提取方法对于大肠杆菌的抑制作用也是不同的,因此不同的中药由于其相适应的提取方法和工艺。本研究结果表明,醋五味子和石榴皮的有效成分提取以乙醇回流法比水煎法更优。

水煎法是以水为溶剂,中药材加热煮沸一定时间从而提取所含成分的一种传统方法,适用于有效成分能溶于水,相对热稳定性好的中药。 在本研究中,水煎法提取中药的抑菌效果不明显,其原因可能是提取液只包含具有水溶性的成分,比较单一,且水煎法温度不好控制,导致本身的提取温度过高,可能破坏了热稳定性较差的成分,使得提取液的抑菌效果减弱;乙醇回流法是用乙醇作为有机溶剂提取药物成分,将每次提取液加热蒸馏,挥发的溶剂在挥发后又被冷凝,周而复始,重复回流提取液,合并提取液再进行浓缩。 此研究中,醋五味子和石榴皮以乙醇回流法制备的提取液抑菌效果较水煎法好,原因可能是提取液中除了水溶性的有效成分外,还有不溶于水的酯类等有效成分的存在。李春远从五倍子提取物中分离得出主要的抑菌活性成分为鞣质[7],并被证实有中等抑菌活性。

因此,不同的中药可根据其有效成分和目标产物的不同,来选取最合适的提取方法和提取工艺,并对其工艺进行优化,以达到最好的提取效果。 研究中药最优的提取方法为进一步分离、纯化单一抗菌成分的研究做了铺垫,有待进一步研究。