犬圆环病毒病研究进展

孙文超，汪 伟,曹 亮，易驰喆，郑 敏，刘立明，赵翠青，鲁会军*，金宁一,4*

(1.温州大学病毒学研究所，浙江温州 325035；2.广西动物疫病预防控制中心，广西南宁 530001；3.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春 130122; 4.广西大学动物科技学院，广西南宁 530004)

圆环病毒是单链环状、无囊膜的病毒，基因组大小2 kb左右，病毒二十面体对称结构。在2012年之前，已知的哺乳动物圆环病毒只有猪圆环病毒1型(Porcine circovirus type 1，PCV1)和2型(Porcine circovirus type 1，PCV2)。PCV1在对猪几乎完全没有致病性，PCV2是猪圆环病毒相关疾病的主要病原体。PCV2感染容易造成免疫抑制性疾病，是危害全球养猪业最重要的病毒之一。PCV2感染主要引起肺炎、肠炎、淋巴结炎、肾炎、繁殖障碍疾病等。PCV2感染经常与其他病毒或细菌混合感染加速或加剧疾病的发生或发展。

近年来，随着分子生物学技术的进一步发展，尤其是高通量测序技术的发展，陆续发现圆环病毒属几种新型圆环病毒，例如蝙蝠圆环病毒[1]、水貂圆环病毒[2]、狐狸圆环病毒[3]及猪圆环病毒3型[4]。2012年，美国首次从205份犬血清检测到6株犬圆环病毒1型(Canine circovirus genotype 1，CaCV1)阳性[5]。随后，Li L等[6]研究认为该病毒与犬出血性腹泻或严重胃肠炎等疾病相关。然而，目前关于该病毒在临床中确切的致病性尚不清楚。

为了避免混淆已经用于其他病毒的简称，例如，金丝雀圆环病毒(Canary circovirus)或犬杯状病毒(Canine calicivirus)，Li L等[6]提出用犬圆环病毒简称DogCV(Dog circovirus)。为了使环状病毒属所有成员的物种名称统一和相似，2015年国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)建议犬圆环病毒英文简写为CanineCV(https://talk.ictvonline.org/)。该病毒的发现给犬病的预防和治疗带来了新的挑战，世界上多个国家和地区开始针对该病毒进行流行病学和致病性的研究。

1 病原特征

CanineCV是一个无囊膜、环状、单链DNA病毒，基因组大小约为2 kb，属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)。该属还包括猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、鸭圆环病毒、鹅圆环病毒、金丝雀圆环病毒、禽白血病病毒、蝙蝠圆环病毒、狐狸圆环病毒等成员。

目前，北美洲的美国、欧洲的德国、意大利、中国台湾地区及中国广西地区均检测到CanineCV的存在，说明该病毒已经在世界范围内广泛传播。根据目前已知核苷酸序列比较，发现不同地区、不同毒株间有所差异。CanineCV 基因组大小为2 063 bp或者2 064 bp，利用在线ORF finder软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)发现美国NY214株存在多达12个ORFs，中国JZ98/2014株存在10个ORFs。阅读框之间存在部分重叠的现象，且大小相差很大。其中有2个主要的阅读框，即ORF1和ORF2，相比较而言，ORF2 变异程度较大，而ORF1更保守一些。ORF1有912个碱基编码303 aa的病毒复制酶(Rep蛋白)，与病毒复制有关。ORF2有813个碱基编码270 aa的病毒衣壳蛋白(Cap蛋白)。利用生物信息学分析Cap蛋白密码子发现，Cap蛋白N端存在一段精氨酸富集的强碱性氨基酸区域(RVRRHARASRRRYRTRPLIRYRRRRQ)，大小为26个氨基酸，该区段的序列特征与PCV2、GoCV等圆环病毒的核定位信号(Nuclear localization signal,NLS)序列相似。该核定位信号是影响圆环病毒原核表达的重要因素。CanineCV基因组中同时包含圆环病毒属高度保守的基序WWDGY、DDFYGW和DRYP；滚环复制特征的保守基序FTINN、TPHLQG和CSK；与dNTP结合的基序GCGKS。ORF1和ORF2这2个基因之间也有2个间隔区域，大小分别为135 nt(1 929-2 063 nt)和203 nt(913-1 115 nt)。CanineCV DNA复制起始区(ori)位于间隔区1 929-2 063 nt，ori呈茎-环样结构，CanineCV茎-环包含10个核苷酸(CATAGTATTA)，该核苷酸基序是滚环复制的剪切位点，与其他圆环病毒、双粒病毒、微病毒基因组类似。同时在环的两侧存在重复序列，形成回文结构。

目前,尚无成功分离到该病毒的报道，因此对于该病毒的病毒粒子大小、浮密度、沉降系数和酸碱耐受性等理化性质不是很清楚。Decaro N等[7]尝试将CanineCV阳性组织样品接种到细胞系如犬纤维瘤细胞系(A-72)、犬肾细胞系(MDCK)、非洲绿猴肾细胞系(Vero)、Walter Reed细胞系(WRCC)等，并且在接种方法上做了多种尝试，如添加300 mmol/L葡糖胺、新鲜胰蛋白酶处理细胞，发现病毒在第4～5代消失，没有分离到该病毒。

2 流行病学

犬是本病的主要自然宿主，目前研究发现，狼和獾等食肉动物也可以感染该病毒。各种年龄、不同性别的犬都可以感染 CanineCV。Decaro Nicola等研究发现，幼龄犬感染率要比成年犬感染率高。Dowgier G等[8]研究证实，CanineCV感染发病率与随着年龄增加显著降低，认为这可能是由于先前感染诱导的特异性免疫反应逐渐清除感染因子造成的。

2013年Li L等[6]利用real-time PCR检测犬的腹泻粪便样品,结果健康犬CanineCV阳性率11.3%(14/204)，腹泻犬该病毒阳性率为6.9%(19/168)，血小板减少症和中性白细胞减少症、未知来源的发热或蜱虫叮咬犬该病毒阳性率为3.3%(19/409)。但通过PCR确定为其他病原体(犬隐孢子虫、贾第鞭毛虫属、沙门菌)感染犬，CanineCV阳性率为68%(13/19)。腹泻犬中大多数的CanineCV阳性者感染超过一种病原体。

Hsu H S等[9]对2012年-2014年的207例腹泻犬和160例健康犬进行腹泻与CanineCV感染之间的关系的研究结果，腹泻犬感染率为28.0 % (58/207)，健康犬感染率为11.9 %(19/160)。58例CanineCV阳性犬中25例为小于1岁的幼犬，25例为1岁～7岁的犬，8例7岁以上犬。CanineCV感染年龄跨度从2个月至13岁(中位数为1岁)。健康组9例CanineCV阳性犬，3例(15.8%)不到1岁，8例(42.1%)在1岁～7岁之间，8例(42.1%)超过7岁，年龄跨度为3个月～18岁(中位数是5岁)。通过比较腹泻犬感染CanineCV与健康犬感染CanineCV之间年龄，发现CanineCV更常见于年龄较小的腹泻犬。

Anderson A等[10]对德国2006年和2014年间收集的犬样本评估CanineCV与急性出血性腹泻综合征(Acute haemorrhagic diarrhoea syndrome，AHDS)的相关性，分别对AHDS犬(55例)、健康犬(66例)和感染犬细小病毒(CPV)犬(54例)粪便样品通过靶向复制酶和衣壳基因的2个实时TaqMan PCR测定来检查CanineCV，结果发现3组间无显著性差异。CPV阳性犬混合感染CanineCV病死率明显高于CanineCV阴性犬，但从恢复时间比较二者之间没有显著性差异。因此，研究认为CanineCV似乎不是犬AHDS的主要致病因子，但该病毒可能在CPV感染过程中扮演着辅助因子的作用。

2016年Zaccaria G等[11]对意大利中南部地区389份家犬、狼、狐狸和獾等野生动物调查CanineCV感染情况，发现狼的阳性率为0.46%(9/34)，犬的阳性率为3.8%(8/209)，狐狸的阳性率为0，獾的阳性率为10%(1/10)。所有阳性动物显示至少感染另外一种重要病原体，包括犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)和犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)，说明该病毒可以感染其他犬科动物。

Gentil M等[12]对来自184例腹泻犬和82例临床健康犬(对照组)的粪便样品检测发现，腹泻犬CanineCV阳性率为20.1%(37/184)，健康对照组为7.3%(6/82)。同时在50%的CanineCV阳性犬中，诊断出其他肠道病原体的感染。

Thaiwong T等[13]通过对粪便和血清学跟踪调查发现，该病毒在犬身上带毒超过1年，推测传播模式可能与PCV2一致，病毒在血清以及鼻中大量存在，粪便排泄后自然感染犬群。目前，尚未有该病毒通过胎盘垂直传播的病例报道。大量试验证实，PCV2感染最常与其他猪病原体混合感染导致临床疾病发生。PCV2常与其他病毒例如猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、细菌感染等继发或者混合感染。研究发现CanineCV常与一些常见、重要的病原体如犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒类2型(CPV2)发生混合感染。这一点二者非常相似，也为下一步研究其传播途径提供了便利。

Dowgier G等调查2013年-2016年期间CanineCV与犬肠胃炎的关系，对照组CanineCV阳性率为28.35%，临床病例组感染率为32.42%，二者差异不显著。临床病例组混合感染较多，CPV2和CanineCV的混合感染率为18.72% (41/219)，与单感染CanineCV相比较差异显著。

2016年，郑敏等[15]对广西崇左市有20份犬血清进行CanineCV阳性率调查，成功检测到1份阳性样品，并完成病毒全基因组序列的测定，随后对广西5个地市犬血清分子流行病研究发现CanineCV感染率在0～30%不等，也证实了大陆地区存在该病毒的流行和传播。

3 致病机制

CanineCV在犬腹泻及犬急性胃肠炎中的确切作用还不明确。2013年，Li L在研究CanineCV过程中发现，病犬出现坏死性血管炎的病理组织学病变、整个胃肠道出血及肠系膜淋巴结呈肉芽肿性淋巴结炎。肠系膜淋巴结的分析显示，髓质窦内的多个巨噬细胞含有空泡、椭圆形、可易染色的细胞质体。

Thaiwong T等[13]报告一个CPV2和CanineCV混合感染的犬群，同时通过PCR证实，并利用ICH/ISH证实病灶内存在抗原/核酸。严重的CPV2感染特征是小肠坏死的隐窝内含有大量的CPV2抗原，导致犬呕吐和出血性腹泻。虽然CPV2也感染淋巴细胞并引起淋巴细胞溶解，但只在淋巴组织和树突细胞中检测到少量的CPV2抗原，而不是坏死区域、肉芽肿炎症的病灶。而在淋巴坏死区域内和肉芽肿炎症灶内的上皮样巨噬细胞内存在大量的CanineCV，这一点支持CanineCV是引起这些部位病变的假说，该现象与猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)类似。这个发现的临床意义在于证实CanineCV可以简单地在淋巴复制。

CanineCV与CPV2感染机制是否与PCV2和猪细小病毒的混合感染类似还不得而知。圆环病毒和细小病毒感染是一种常见的混合感染模式，非特异性免疫刺激足以引起猪严重的圆环病毒病。他们推测CPV2感染导致隐窝上皮细胞和淋巴细胞坏死，随后导致再生上皮细胞和淋巴母细胞的增殖，为CanineCV复制提供必要的靶细胞，最终导致更严重的临床疾病。

Anderson A等[10]认为，虽然Li L等报道在血管炎和出血性肠炎的犬肠道检测到CanineCV DNA，但是在健康犬中同样检测到，健康犬CanineCV感染率为4.6%。因此，CanineCV有可能是非致病性的肠道微生物被偶然发现的。这一点与PCV1在无症状的猪体检测到类似[14]。目前，大家普遍接受PCV1感染猪是没有致病性的。在犬腹泻的粪便中检测到CanineCV DNA并不一定意味着这种病毒具有致病性。临床中CanineCV与CPV2经常发生混合感染，CanineCV有可能长时间无害化停留在胃肠道，胃肠道病毒易位可能增强对黏膜损害。CanineCV可能会影响肠黏膜屏障增加犬的死亡率，特别是感染CPV2的犬。

4 分子生物学诊断技术

4.1 原位杂交技术

原位杂交技术(in situ hybridization,ISH)是应用已知碱基序列并带有标志物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体,然后再应用与标志物相对应的检测系统,通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号,在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。Li L等[6]利用ISH寡聚探针检测21例怀疑CanineCV阳性犬，结果发现只有4例阳性，对照组犬的所有其他组织样品ISH分析均为阴性。ISH可用于检查CanineCV在病犬的脏器分布。Thaiwong T等[13]建立针对复制酶基因序列寡核苷酸探针对组织器官进行了检测验证，在犬的淋巴组织中检测到大量CanineCV核酸。

4.2 荧光定量PCR方法

Li L等[6]分别建立了针对Replicate 基因和Capsid基因的荧光定量探针法，Nicola D等重复Replicate 基因的荧光定量探针法验证该方法的可行性，发现死亡犬的肝脏和肠道周期阈值(CT)分别为26.4和24.3。Hsu H S等[9]根据 CanineCV NY21株基因序列设计SYBR Green 荧光定量检测方法，CanineCV检测阳性率为35.7 % (74/207)。孙文超等[16]根据JZ98/2014的基因序列,建立犬圆环病毒SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法，该方法检测灵敏度可达4.67×101copies/μL。

4.3 PCR方法

PCR方法是检测病毒和细菌的常用方法。该方法具有快速、简便、特异强等特点。Gentil M等根据 CanineCV的基因序列设计出特异的PCR引物进行病毒检测,建立了特异的 PCR方法，检测结果表明腹泻犬组中，CanineCV的阳性率为20.1%(37/184)，健康对照组为7.3%(6/82)。

5 展望

关于CanineCV与腹泻相关研究只局限于临床研究，而对该病原的分子致病机制及与其他病原之间的协同致病机制等认识非常有限。因此，未来需要解决以下几个方面的问题：首先，病毒的分离及其细胞培养体系的建立，目前还没有适合的细胞系或者成功的病毒培养方法。其次，利用常规的病毒学手段难以解决上述问题，反向遗传技术将是最重要的手段之一，PCV2反向遗传操作的成功可以提供很好的参照。第三，病原与宿主的相互作用，阐明CanineCV的致病机制是与致病性PCV2类似，还是与无致病性的PCV1类似。第四，需要阐明CanineCV与其他腹泻相关病原，如CPV2、CDV混合感染是否会加重疾病的发生。尽管国内外许多实验室对CanineCV进行大量的研究，但病毒对动物免疫系统影响、致病机制等方面仍缺乏全面而系统的了解，相关的研究工作有待进一步深入。

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