小细胞肺癌中Notch1信号通路、ASCL1与EMT关系研究进展

周怡然，辛 宇，陈 骏

(大连医科大学附属第二医院 肿瘤科，辽宁 大连 116027)

小细胞肺癌(SCLC)是各种类型肺癌中恶性程度最高的肿瘤，约占所有肺癌的15%～20%，其5年生存率<6%[1-2]。过去几十年中，SCLC的一线化疗方案仍以顺铂或卡铂加依托泊苷为主，尽管其暂时对放化疗敏感，但很快出现复发和转移[3-5]。上皮-间质转化(EMT)是一种导致组织重塑的复杂的分子和细胞过程，通常作为肿瘤进展、转移和耐药的机制被广泛研究。所以我们需要更深入地了解SCLC的发生、发展、转移、耐药的细胞和分子机制以改善目前治疗方案。基于对SCLC细胞生物学、分子生物学更深的理解以及SCLC鼠模型的建立，潜在的治疗靶点可能帮助人类克服SCLC治疗上的困难[3]。本文将对Notch信号通路、ASCL1基因的表达与EMT的关系及其相关潜在治疗靶点在SCLC治疗中的新进展作一综述。

1 SCLC的EMT样特征

1.1 EMT

EMT是指上皮细胞间以及细胞与基质间的粘附性丢失、重塑，失去上皮特征而获得间质细胞表象的生物现象。EMT不仅参与胚胎发育、创伤修复，在肿瘤的侵袭转移过程中亦发挥重要作用。EMT过程中主要转录因子包括Snail家族，碱性螺旋-环-螺旋转录因子(basic Helix-Loop-Helix，bHLH)家族成员Twist(Twist1，Twist2)和E盒结合锌脂蛋白(ZEB1，ZEB2)；信号通路包括转化生长因子-β(TGF-β)信号通路、Notch信号通路、Wnt信号通路等[6]。EMT过程中，E-Cadherin/β-Catenin复合体的缺失是其发生标志。肿瘤细胞发生EMT不仅伴随着分子相关标志物表达的变化，而且还发生细胞形态学改变，从而使细胞获得运动、侵袭能力。

1.2 SCLC细胞特征与EMT

SCLC组织学特征之一是具有不成熟的外观。SCLC细胞显示：细胞低分化，无细胞器，细胞核呈圆形、纺锤形，染色质分散、呈细颗粒状，胞浆稀少，核仁缺乏或不明显[7-8]；细胞间连接减少；具有不规则和不连续基底层的顶端极性丧失[7]；远离上皮结构的圆形和梭形细胞； E-Cadherin表达降低，N-Cadherin表达增加[9]；偶发的伪足样细胞质过程和金属蛋白酶(metal loprotease，ML)活性增强[10]。从EMT转录调控的观点来看，人SCLC细胞系比NSCLC细胞系显示出更高的Snail，Slug和ZEB2的表达，并且这些转录因子可以促进EMT。Dr.Pöpper[11]报道了在NSCLC中，组织细胞成簇移动，而SCLC细胞在单细胞或小细胞簇移动中迁移。另外报道证实SCLC细胞模拟白细胞沿着血管壁滚动[12]。所有这些观察结果都可以支持SCLC具有EMT样特征。

2 Notch1信号通路与ASCL1

Notch1信号通路与ASCL1在EMT的调控中具有重要意义，Notch1信号通路可以通过Hes1基因调节ASCL1的转录，同时也可对ASCL1进行转录后调节[13],两者相互作用共同调控SCLC EMT的发生。

2.1 Notch1信号通路在EMT中的意义

2.1.1 Notch1信号通路

Notch1是Notch信号通路中最常被检测到的Notch受体家族成员。Notch1编码一种相对分子质量为300 kDa的跨膜蛋白受体，受体的胞内区(Notch intracellular domain，NICD)是Notch的活化形式，当受体与配体结合时，Notch1受体经过ML、肿瘤坏死因子-α转化酶和γ-分泌酶复合物切割后，释放其胞内段的活性成分NICD，随后，NICD进入细胞核，其RAM区结合CSL蛋白并募集核转录激活蛋白家族MAML，形成转录激活子，从而激活下游基因[14]。

DLL3是Notch配体之一，同时也是ASCL1的直接下游靶点[15]。哺乳动物Notch家族配体DLL1、DLL4、JAG1和JAG2各自1激活Notch受体信号通路[16]。相反，DLL3主要定位于高尔基体，不能激活Notch信号[17]。在正常发育中，DLL3通过与Notch和DLL1相互作用并分别将其重新定位或保留到晚期溶酶体或高尔基体，从而阻止它们定位于细胞表面，抑制Notch信号通路的传导[17-18]。因此，DLL3可能与神经内分泌表型有关，并有助于NET发生。在包括SCLC在内的NET中，DLL3高度上调并在细胞表面异常表达，使其成为潜在的治疗靶点[19]。

2.1.2 Notch1信号通路与EMT的关系

SCLC有很高的突变负荷。110例SCLC患者样本的全基因组测序显示，约25%的SCLC中Notch家族基因存在失活突变，表明这些基因是SCLC中肿瘤抑制因子[20]。有研究观察到 Notch信号的激活导致SCLC转基因小鼠模型中肿瘤明显减少、存活时间延长，进而支持了这一观点[21]。H69是一种经典的SCLC细胞系，显示出没有Notch1表达的神经内分泌分化，H69AR是一种表达Notch1而失去神经内分泌分化的化学耐药变体，是一种变异的SCLC细胞系。通过H69 SCLC细胞的实验研究揭示Notch信号通路在SCLC的细胞形态、粘附、运动性和耐药性中的意义[22-24]。H69细胞漂浮在培养皿中，但是经NICD基因转染的细胞呈现出粘液生长模式。NICD诱导产生上皮标志物如E-Cadherin和CD44，并减少EMT相关转录因子，如Snail和Slug。此外，NICD转染H69细胞系的异种移植肿瘤组织学显示SCLC与腺癌混合组分。在体外基质跨膜侵袭试验中，抑制Notch基因表达的H69AR细胞的侵袭能力比对照组H69AR细胞的侵袭能力增强。

2.2 ASCL1在EMT调控中的作用

ASCL1是bHLH基因家族成员之一。ASCL1作为一种转录因子，不仅在肿瘤的神经内分泌分化过程中起重要作用，而且通过诱导EMT，增加神经内分泌肿瘤的转移、侵袭能力。有研究发现，SCNN1A编码的上皮钠离子通道α亚单位(the alpha subunit of theepithelial sodium channel，αENaC)与SCLC中ASCL1表达水平相关，即αENaC在ASCL1依赖型(ASCL1高表达)SCLC中呈高表达状态[25]。作为一种口服保钾利尿剂，先前已有报道阿米洛利在多项生化和细胞分析研究以及动物模型研究中具有抗肿瘤和抗转移功能[26-27]。为了确定αENaC抑制是否可以模拟ASCL1功能丧失效应以降低细胞活力，研究测试了阿米洛利对H889 ASCL1高表达和H82 ASCL1低表达SCLC细胞和永生化HBEC3KT细胞活力的影响。随着阿米洛利浓度的增加，H889细胞活力下降，但对H82或HBEC3KT细胞活性无影响[25]。因此我们可以推断，SCNN1A/αENaC是SCLC种系特异性基因ASCL1的直接转录靶点，可运用药理学靶向进行抗肿瘤作用。然而，此项研究目前仅处于基础实验阶段，临床研究还有待于进一步开展。

2.2.1 ASCL1在SCLC的意义

SCLC是一种常见的NET，人体神经和神经内分泌组织的分化依赖于ASCL1的作用。Blges等[24]首先报道了ASCL1在鼠胚胎发育和人类SCLC神经内分泌分化中的意义。在鼠胚胎发育中敲除ASCL1基因，会导致肺神经内分泌细胞的缺失。相反，在转基因鼠中过表达ASCL1能够促进气道上皮增生，ASCL1与SV40(simian virus 40)大T抗原共同转染能够促进具有神经内分泌特征的肺肿瘤形成[28]。

2.2.2 ASCL1诱导EMT的意义

ASCL1不仅可以促进神经内分泌分化，还在肿瘤细胞的生长、存活、迁移和侵袭中发挥作用。SCLC细胞系中ASCL1的下调可抑制软琼脂上细胞克隆生长并诱导凋亡，其高表达可促进NET的发生。此外，ASCL1可能通过改变CDK5/P35表达来促进癌细胞迁移和侵袭[29]。综合来看，ASCL1除了具有促进神经内分泌的功能外，还可能参与癌细胞迁移，有助于SCLC的侵袭、转移。

人腺癌细胞系中ASCL1基因的转染研究已有报道，并且在转染的细胞中证实了具有神经内分泌分化功能。关于EMT，Osada等[30]报道，ASCL1转染的肺癌细胞显示出一种变形虫迁移表型，可能与E-Cadherin/β-Catenin复合体的缺失相关。当用ASCL1基因转染时，腺癌细胞丧失粘附性并漂浮在培养皿中。在ASCL1基因转染细胞中，除神经内分泌标志物的表达外，EMT相关转录因子如Snail，Slug和ZEB2增加，而E-Cadherin降低。当将ASCL1转染的腺癌细胞移植到免疫缺陷小鼠的皮下组织中时，异种移植的肿瘤由小细胞和没有上皮结构的大细胞组成，表现出未分化的组织学特征。

3 DLL3抑制剂在临床中的应用

Rova-T(Rovalpituzumab tesirine)是一种新型DLL3的靶向性单克隆抗体和细胞毒药物的耦联物[31]。2015年欧洲医学肿瘤学会(ESMO)会议上，Pietanza等[32]报告了79例接受一线或二线治疗后进展的SCLC患者接受Rova-T治疗的Ⅰ期临床试验结果，结果显示约三分之二的SCLC患者DLL3高表达。Rova-T在复发转移性SCLC和大细胞神经内分泌肺癌患者中首次进行的人体Ⅰ期临床试验结果于2017年发表[33]。在65例可评估的患者中，17%有确切的疗效反应，54%疾病稳定。中位随访时间为5.6个月(95%CI 2.5-8.3)，中位PFS为3.1个月(95%CI 2.7-4.1)，中位OS为4.6个月(95%CI 3.9-7.1)。DLL3高表达(定义为至少50%的肿瘤细胞中可检测到蛋白表达)的情况下，ORR为39%，疾病控制率(疾病稳定或客观反应)为89%。最值得注意的是，在具有可用于蛋白组织分析的患者中，仅可在具有高DLL3表达水平的那些患者中观察到疗效反应，进一步支持了Rova-T疗效与DLL3表达水平相关的临床前观察[33]。在探索性分析中，DLL3高表达亚组的中位PFS为4.5个月(95%CI 3.0-5.4)，DLL3低表达亚组的中位PFS为2.3个月(95%CI 1.3-3.3)，但没有报道DLL3高表达和DLL3低表达亚组之间的总存活率差异[33]。同时，通过I期临床试验结果，研究人员确定了II期试验的推荐剂量和时间表(0.3 mg/kg，每6周1个周期)，并确定了剂量限制性毒性，包括血小板减少症，肝功能异常和浆膜腔积液[33]。这些数据支持DLL3作为该疗法的候选预测性生物标志物，并且这些结果在预先治疗的患者群体中似乎很有前景。然而，还需要进一步的研究来确定Rova-T治疗的临床益处，并且有关该药物的多项试验也正在进行中。

4 展 望

肿瘤细胞中还存在其他与EMT相关的诱导因子及其信号通路，此外，Notch1的表达在SCLC和NSCLC中表达的差异反应了Notch信号通路在两类肿瘤中具有复杂的作用机制，因此，深入的研究有助于揭示Notch信号通路与肿瘤发生、发展的关系。基于ASCL1对NET高度的特异性和敏感性，ASCL1可能成为肺NET尤其是SCLC的临床病理诊断标志物。更值得期待的是，Notch1和ASCL1相关研究可能为SCLC提供更多的治疗靶点，为SCLC患者带来新的希望。

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