浅析基因检测技术

刘 燕 许友强 周婷婷 刘明珠 李雨艳

（吉林金域医学检验所有限公司实验诊断部，吉林长春 130000）

在众多基因检测技术中，测序技术无疑是最为直观、准确的方法之一，并且随着基因检测在医学检验中的不断应用发展，其检测技术也在不断进步，从第1代测序技术至今已经发展到了第4代测序技术[1]。本文旨在对基因检测技术的发展历程及4代测序技术的基本原理和医学应用进行浅析。

1 第1代测序技术

目前为止，第1代测序技术是指由Sanger于1977年发明的双脱氧末端终止法测序，也称Sanger测序。其基本原理是，用放射性同位素标记的引物进行PCR扩增反应，引入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），它与普通的脱氧核苷酸（dNTP）不同，不能合成磷酸二酯键，迫使DNA链立即停止延长，其合成反应也将终止，通过调节ddNTP 和dNTP的比值可以得到不同长度的片段，最后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对合成的各个大小的片段进行分离，得到整个片段的序列信息。到了20世纪80年代，用荧光标记代替放射性同位素标记，发展为荧光自动测序技术，到了20 世纪90 年代，毛细管电泳技术和微阵列毛细管电泳技术发展迅速，出现了带有荧光标记的毛细管电泳测序方法，使得测序技术在效率和安全性上有了显著的提高。

2 第2代测序技术

第2代测序技术亦称下代测序技术，可以同时将几十万到几百万条DNA分子进行测序，全面细致的对基因组进行测序，因此又叫深度测序，与第1代测序技术相比是一场划时代的变革[2]。第2代测序技术主要采用边合成边测序的基本原理，可以在测序反应正在反应的同时收集测序信号，主要是将基因组DNA片段连接上通用接头，然后进行扩增反应合成大量的多克隆序列，进而平行测序，经生物信息学技术计算后获得完整的序列信息，并进行数据分析，鉴定是否存在基因突变，SNP 位点等，从而诊断相应的疾病。

第2代测序技术和第1代测序技术相较，具有通量高，自动化程度高，测序速度高，成本低等优势，是迄今为止应用最为广泛的一类测序技术。其在临床诊疗方面的应用也非常广泛，检测基因突变可用于肿瘤的诊断（肺癌基因热点突变和融合检测、实体肿瘤关键基因热点突变和融合检测、结直肠癌/肺癌组织样本中突变热点检测等）；遗传性疾病筛查（线粒体疾病、遗传性耳聋及神经肌肉障碍等）；染色体非整倍体无创产前筛查：胎儿的染色体异常遗传病中最主要的就是染色体非整倍体，其中以21三体（唐氏综合征）、18三体（爱德华氏综合征）和13三体（Patau综合征）为主要形式，现阶段的医疗水平对于非整倍性染色体病并没有可靠的治疗方案，唯一有效地方法就是对孕妇进行产前筛查与诊断；在胚胎植入母体前进行遗传学的筛查等[3]。经过了几十年的探索和研究，第2代测序技术在临床的应用已经十分成熟。

3 第3代测序技术

第3代基因测序技术主要是以单个分子读取技术为原理。包括单分子实时测序技术、离子半导体测序技术、HeliScope单分子测序等技术[4]。其中最成熟的为SMRT技术，该技术的核心是采用零级波导技术检测单分子荧光信号。荧光标记的dNTP与模板结合形成磷酸二酯键，3’端标记上荧光基团，在DNA 聚合酶的作用下被切去，其荧光信号经ZMW检测，ZMW 芯片上有许多小孔，直径只有数十纳米，远短于激光的波长，使激光无法穿过小孔，并在光线照射时呈现指数衰减的消逝波，但可以将激发的小于波长的荧光局限在小孔内，且DNA 聚合酶结合在小孔内进而形成一个检测的空间，检测激发的荧光信号，只有靠近基质的荧光信号会被保留，消除背景荧光的干扰，根据得到的荧光信号光谱来区分不同碱基，进而得到DNA 序列。

第3代测序技术在第2代测序技术基础上增加了读长，而且不经PCR技术进行DNA扩增，直接进行边合成边测序，因此缩短了测序时间，降低了试剂成本，而且不受胞嘧啶和鸟嘌呤含量的影响。第3代测序技术的读长优势可弥补第2代测序技术的不足，其在临床上可以用于病毒基因组的研究，对经病毒侵染的疾病在治疗中具有重要意义；与第1、第2代测序技术相比，在某些医学领域中有着广泛的应用，如对遗传学领域中SNP位点检测及甲基化识别具有很高的分辨率；在RNA的检测方面也有广泛应用，对于在21三体综合征的检测中具有重大意义，根据第3代测序技术的miRNA测定可以提高诊断的正确率。

4 第4代测序技术

第4代测序技术也可称为纳米孔的单分子测序技术，该技术主要是采用电信号原理进行序列测定的，用于DNA测序的纳米孔有生物的纳米孔以及固态的纳米孔两种，生物纳米孔，又叫跨膜蛋白通道，有α-溶血素纳米孔和蛋白纳米孔，固态纳米孔有石墨烯纳米孔、聚合物膜和其他混合材料。第4代测序技术利用不同碱基具有不同的电学性质，通过纳米孔直接对碱基穿过电极时的电信号进行测量，进而识别碱基的排列顺序。原理主要为DNA一端与特殊的蛋白相连，使DNA 的正义链和反义链先后通过纳米孔，由于ATCG 这4 种碱基电学性质不同，穿过纳米孔的时候电流变化量也不同，通过对电信号的改变进行解析，得到DNA序列。

第4代测序技术是一类测序的新方法，将电子传导的技术与单分子的检测技术相结合，摒弃了PCR 扩增和洗脱DNA的过程，尽可能规避了在实验过程中造成的误差，并且具有更高通量、更长读长、更短测序时间、更低成本和更简单的数据分析等优势[5-6]。在应用方面，第4代测序技术可以用于RNA 测序、检测单链及双链DNA片段、重复序列及Poly 结构的测定、蛋白质的检测等，在临床和医学方面，特别是在癌症上的研究起着领头羊的作用。

5 结语

第1代测序技术仍然是基因检测的金标准，但其通量低，测序成本高，对于检测单基因的突变以及通量较少的测序是最优的选择。第2代测序技术发展成熟，通量高及成本低，但其主要的弊端是测序长度相对较短。第3代测序技术采取单分子的读取技术，比第2代测序的数据读取速度更加迅速，而且在第2代测序基础上提高了读长，但随之带来的是测序的数据准确性不高。第4代测序技术与前3代测序技术比较，采用纳米孔电子传导技术进行碱基检测，可以避免在洗脱和扩增的过程中造成的误差，在成本、速度和通量等方面有了显著的提高，但其仍面临很多挑战，处于发展中的状态[7]。

总之，不同的测序技术有各自的优缺点，也为临床检测提供了更多更方便的选择，促进了临床医学的进步，有理由相信，基因测序技术在未来的医学检验更加发光发热。