复方鳖甲软肝片联合恩替卡韦片对慢性乙肝肝纤维化患者外周血Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达影响

高乾峰

(安徽医科大学附属六安医院，安徽 六安 237005)

慢性乙型肝炎(乙肝)是由乙肝病毒导致的以肝脏炎性病变为主，可引起多器官损害的疾病，该病具有发病率高、病程长、预后差等特点[1]。慢性乙型肝炎患者在乙肝病毒为主的多种因素影响下，肝细胞出现炎症性损伤，引发肝纤维化、肝硬化、肝癌，肝纤维化为慢性乙肝发展为肝硬化的中间环节，抑制病毒复制并阻断肝纤维化进程对逆转肝纤维化和预防肝硬化具有重要意义[2]。恩替卡韦为新一代鸟嘌呤核苷类似物抗HBV药物，可有效抑制HBV复制，下调转化生长因子(TGF-β)水平，改善慢性乙肝患者肝纤维化程度[3]。中医认为慢性乙肝肝纤维化与湿热之邪内蕴致肝络气滞血瘀、瘀血久留成块有关，复方方鳖甲软肝片具有软坚散结、活血化瘀、滋阴潜阳之功效，联合抗病毒药物可有效改善患者肝功能和肝纤维化程度[4]。本研究观察了复方鳖甲软肝片联合恩替卡韦片对慢性乙肝患者外周血Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达的影响，旨在探讨复方鳖甲软肝片治疗慢性乙肝肝纤维化的作用机制，为慢性乙肝肝纤维化的防治提供更多参考，现将结果报道如下。

1　临床资料

1.1一般资料选择 2014年6月—2016年5月在我院就诊的慢性乙肝肝纤维化患者94例，血清HBsAg阳性，血清肝纤维化指标、超声弹性成像、CT或磁共振等检查符合肝纤维化诊断标准[5]；中医辨证符合正虚血瘀标准[6]：疲倦乏力、食欲不振、大便异常、肝区不适或胀或痛、面色晦暗、舌质暗红、舌下静脉曲张、脉弦细。患者既往无肝病或肝纤维化史；初治或停用抗HBV药物6个月以上，且6个月内未应用过抗肝纤维化药物；患者对研究知情并签署知情同意书。排除既往合并酒精性、非酒精性肝病或药物性肝炎者；失代偿期肝硬化、其他类型肝炎病毒感染或合并HIV感染者；毒品依赖、药物依赖或酒精依赖者；妊娠、哺乳期妇女；合并恶性肿瘤、肾功能障碍者；依从性差，不能按规定服用药物或随访者；对研究药物过敏者；精神疾病或认知障碍者；拟纳入其他临床研究者。随机将患者分为2组：对照组47例，男27例，女20例；年龄28～59(42.54±8.45)岁；病程(5.35±4.13)年；肝纤维化程度：轻度34例，中度13例。观察组47例，男24例，女23例；年龄30～60(43.12±8.71)岁；病程(5.47±4.62)年；肝纤维化程度：轻度31例，中度16例。2组患者性别、年龄、病程、病情比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性。

1.2治疗方法2组患者均给予合理营养、低脂饮食，维持水电解质平衡，避免应用肝毒性药物，并嘱其忌酒。在此基础上，对照组给予恩替卡韦(苏州东瑞制药有限公司，国药准字H20100129，规格：0.5 mg)0.5 mg口服，1次/d。研究组在对照组治疗基础上给予复方鳖甲软肝片(内蒙古福瑞医疗科技股份有限公司，国药准字Z19991011，规格：0.5 g)2 g口服，3次/d。2组疗程均为48周。

1.3观察指标①治疗前后抽取患者静脉血10 mL，采用PCR荧光定量法检测HBV DNA，采用全自动生化仪检测血清总胆红素(TBil)、谷丙转氨酶(ALT)水平；采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，无菌PBMC用培养基调节至1×106mL-1，放入24孔板，加入刺激剂、伊屋诺霉素和阻断剂，在37 ℃、5%CO2条件下培养5 h,CD3、CD4、CD8表面标记染色固定，室温避光放置20 min,洗涤后采用流式细胞仪检测CD4+Th17细胞表面趋化因子受体CCR4、CCR6、CXCR3表达百分率；采用酶联免疫吸附法检测血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)和人Ⅲ型前胶原(PCⅢ)水平。②治疗前后采用彩色超声多普勒检查门静脉内径、脾脏厚度。

2　结　　果

2.12组治疗前后肝功能和HBV DNA水平比较2组治疗前ALT、TBil、HBV DNA水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；2组治疗后ALT、TBil、HBV DNA水平均显著降低(P均<0.05)，且观察组治疗后ALT、TBil明显低于对照组(P均<0.05)；2组治疗后HBV DNA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　2组治疗前后肝功能和HBV DNA水平比较

注：①与治疗前比较，P<0.05；②与对照组比较，P<0.05。

2.22组治疗前后Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达量比较2组治疗前Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；2组治疗后CCR4、CCR6、CXCR3表达量均显著降低(P均<0.05)，且观察组明显低于对照组(P均<0.05)。见表2。

表2　2组治疗前后Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达量比较%)

注：①与治疗前比较，P<0.05；②与对照组比较，P<0.05。

2.32组治疗前后血清纤维化指标比较2组治疗前HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；2组治疗后HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ均显著降低(P均<0.05)，且观察组明显低于对照组(P均<0.05)。见表3。

表3　2组治疗前后血清纤维化指标比较

注：①与治疗前比较，P<0.05；②与对照组比较，P<0.05。

2.42组治疗前后静脉内径和脾脏厚度比较2组治疗前门静脉内径、脾脏厚度比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；2组治疗后门静脉内径、脾脏厚度均显著降低(P均<0.05)，且观察组明显低于对照组(P均<0.05)。见表4。

3　讨　　论

乙肝患者长期病毒感染可导致持续性炎症浸润，出现肝实质坏死等炎症病理变化，肝星状细胞激活并增殖，产生大量胞外基质，引起肝纤维化，如不及时干预，可导致肝硬化[7]。Th17细胞为新发现的CD4+辅助性T细胞亚群，可分泌IL-17、IL-21、IL-22等促炎递质并参与炎症反应调控，在慢性乙肝的病情进展过程中，Th17在肝脏组织大量浸润并分泌促炎递质介导肝脏的炎症反应，造成肝功能损伤，促进肝脏纤维化，且患者外周血Th17数量及Th17相关因子水平与ALT和病毒载量成正比[8]。CCR4、CCR6、CXCR3为Th17细胞产生的主要趋化因子受体，在炎症过程中与趋化因子与3种受体上的G蛋白发生耦联，导致炎症细胞的迁移和活化，触发三磷酸肌醇形成、胞内钙离子释放、蛋白激酶C激活等一系列细胞级联反应，构成炎症细胞附壁、定向移动到炎症部位并攻击靶细胞的基础[8]。孙立华等[9]研究显示，慢性乙肝患者外周血Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达量显著高于正常对照组，且随慢性乙肝病情加重，Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达量逐渐增加，且CCR4、CCR6、CXCR3表达量与HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C等肝纤维化指标呈正相关。因此CCR4、CCR6、CXCR3有望成为治疗慢性乙肝的新靶点。

表4　2组治疗前后门静脉内径和脾脏厚度比较

注：①与治疗前比较，P<0.05；②与对照组比较，P<0.05。

目前临床治疗慢性乙肝肝纤维化的原则为最大限度地抑制HBV复制，减少肝细胞损害和炎性坏死，阻断或逆转肝纤维化进程，延缓和减少肝硬化、肝癌的发生[10]。恩替卡韦为环戊酸鸟苷类似物，在细胞内磷酸激酶的作用下生成三磷酸盐，可作用于HBV DNA复制的起始、反转录和DNA正链合成3个环节，是治疗乙肝病毒感染的常用药物[11]。恩替卡韦的抗病毒作用可抑制肝脏局部炎症和肝星状细胞活性，具有一定抗纤维化作用[12]，但单独应用临床效果欠佳。

中医认为慢性乙肝肝纤维化系久病湿热邪毒伤及肝脾，体虚伤肾，三脏邪气留恋，致气结血瘀，阻于肝络，积聚而成癥瘕，治宜软坚散结、化瘀解毒、益气养血[13]。复方鳖甲软肝片由鳖甲(制)、莪术、赤芍、当归、三七、党参、黄芪、紫河车、冬虫夏草、板蓝根、连翘组成，方中鳖甲滋阴潜阳、软坚散结，莪术破血消积，赤芍散瘀止痛，当归补血活血，三七消散瘀滞，党参、黄芪健脾益气，紫河车补肾益精、益气养血，冬虫夏草补虚益精气，板蓝根、连翘清热解毒，诸药合用，既可扶正祛邪，又具活血化瘀之功效。相关临床研究显示，复方鳖甲软肝片联合恩替卡韦可通过不同的作用途径呈现作用，中医软坚散结、化瘀解毒、益气养血，改善患者症状，西医抑制HBV病毒复制，二者具有协同作用，联合应用可显著降低慢性乙肝肝纤维化患者肝纤维化指标[14]。

本研究结果显示，治疗后观察组ALT、TBiL，Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达量，血清HA、LN、Ⅳc、PCⅢ水平及门静脉内径、脾脏厚度均明显低于对照组，提示复方鳖甲软肝片联合恩替卡韦可改善患者肝功能，减轻肝纤维化程度，降低Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达可能是其重要作用机制，其详细机制尚有待进一步研究探讨。

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