不同木霉菌株对黄瓜枯萎病菌的拮抗作用

谷祖敏，毕　卉，张　兵，田晓颖

(沈阳农业大学 植物保护学院，沈阳　110161)

黄瓜枯萎病[Fusariumoxysporumf. sp.cucumerinum]在露地和保护地栽培黄瓜上均可发生，连作地区尤为严重，现已成为世界范围内影响黄瓜生产的毁灭性土传病害，发病率一般为 20%～30%，受害重的地区发病率高达 80%～90%以上，甚至绝产[1]。化学农药的大量使用在防治植物土传病害的同时，也杀死环境中的有益微生物，严重破坏农业生态系统，造成环境污染。木霉菌是一种防治蔬菜土传病害的理想生防资源，国内外已有很多关于利用木霉菌防治瓜类枯萎病的报道[2-5]。

不同生防木霉菌对不同植物病原真菌表现不同的作用方式，国内外关于不同种类的木霉菌株对同一种病原菌的拮抗作用鲜见报道。本试验通过比较不同木霉菌株对黄瓜枯萎病菌在竞争作用、重寄生作用、抗生作用和防病作用方面的差异，筛选出高效生防菌株，以期为利用木霉菌防治土传病害提供依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

生防菌株：长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)TL菌株、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)TH菌株、绿色木霉(Trichodermaviride)TV菌株、康宁木霉(Trichodermakoningi)TK菌株；致病菌：尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)，均由沈阳农业大学农药科学实验室提供。

供试培养基：PDA培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL)，用于室内抑菌试验培养木霉菌和黄瓜枯萎病菌；玉米粉沙土培养基(玉米粉∶沙土∶水=1∶1∶0.8，质量比)，用于盆栽试验扩繁黄瓜枯萎病菌接种物；麦麸稻壳玉米粉培养基(麦麸∶稻壳∶玉米粉=6∶1.5∶2.5，质量比)，用于盆栽试验扩繁不同木霉菌分生孢子。

供试黄瓜种子：‘荷兰M6’。

1.2　试验方法

1.2.1不同木霉菌株对黄瓜枯萎病菌竞争作用的研究采用平板对峙法，分别将不同木霉菌株菌饼和黄瓜枯萎病菌菌饼(d=5 mm)同时接种到PDA平板上，相距约4 cm，以单独接种黄瓜枯萎病病菌的平板为对照，重复3次，28 ℃恒温培养 5 d，测量黄瓜枯萎病菌的菌落直径。以木霉菌株对黄瓜枯萎病菌菌丝扩展的抑制率评价竞争作用。

抑菌率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-0.5)×100%

1.2.2不同木霉菌株对黄瓜枯萎病菌重寄生作用的研究参考乔宏萍等[6]的方法，用解剖刀划取15 mm×10 mm PDA膜，置于载玻片上，挑取不同木霉菌和黄瓜枯萎病菌的菌丝分别接种于PDA膜两端，28 ℃恒温培养，逐日镜检观察两菌交界处菌丝生长状况。

1.2.3不同木霉菌代谢产物对黄瓜枯萎病病菌生物活性的研究木霉菌代谢产物的制备：将木霉菌分别接种在含100 mL 发酵培养基的250 mL 三角瓶中，28 ℃，150 r/min，振荡培养5 d。将发酵液离心去除菌丝后，取上清液以0.22 μm 无菌滤膜过滤得到木霉菌代谢产物，待用。

木霉菌代谢产物对黄瓜枯萎病菌的抗生活性：参考王革等[7]的方法，挑取黄瓜枯萎病菌的菌丝放入熔化后冷却至40 ℃左右的PDA中，摇匀倒平板，凝固后，平板中央放置牛津杯，向牛津杯中分别加入50 μL 不同木霉菌的代谢产物，28 ℃培养3 d，测量抑菌圈直径。

木霉菌代谢产物对黄瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用：分别取50 μL不同木霉菌代谢产物加入9 cm培养皿中，倒入熔化后冷却至40 ℃左右的PDA，迅速混匀。凝固后，平板中央接种黄瓜枯萎病菌的菌饼(d=5 mm)，以滴加50 μL空白发酵培养基的处理作为对照，重复3次。28 ℃恒温培养5 d，测量黄瓜枯萎菌菌落直径。

菌丝生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-0.5)×100%

木霉菌代谢产物对黄瓜枯萎病菌孢子萌发的抑制作用：取1滴黄瓜枯萎病病菌孢子悬浮液(浓度约为1×106mL-1)加入凹玻片的凹坑中，再加1滴不同木霉菌代谢产物，混合均匀，28 ℃保湿培养，12 h 后镜检并统计孢子萌发率。

1.2.4不同木霉菌株对黄瓜枯萎病防病作用的研究黄瓜枯萎病菌接种物的制备：将黄瓜枯萎病菌菌饼接种至玉米粉沙土培养基中，每瓶接种4个菌饼，放入25 ℃恒温箱培养14 d，培养基表面长满菌丝，取出培养物，待用。

木霉菌接种物的制备：分别将不同木霉菌饼接种至麦麸稻壳玉米粉培养基，每瓶接种4个菌饼， 25 ℃恒温培养10 d，将培养物过筛，获得木霉分生孢子。

盆栽试验：先将不同木霉菌分生孢子与育苗土混合(木霉浓度为108g-1)，装入育苗盘中，播种已催芽的黄瓜种子，7 d之后移栽到装有4%黄瓜枯萎病菌接种物的营养钵(18 cm×12 cm)中，每钵移栽3株黄瓜幼苗，以育苗土中不加木霉的处理为对照，每个处理重复5次。最后将营养钵置于温度25 ℃、相对湿度60%～70%气候培养箱中，14 d后调查黄瓜发病情况。

结果调查：黄瓜枯萎病的分级标准参考柏敏战等[8]的方法，按下式计算病情指数和防病效果。病情指数=∑(各级病株数×级数)/(调查总数×最高级代表数)×100，防病效果=(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100%。将植株拔出洗净、晾干，用剪刀沿茎基部剪开，称量各处理地上部分鲜质量和地下部分鲜质量。地上部分鲜质量促进率=(处理组茎叶质量-对照组茎叶质量)/对照组茎叶质量×100%，地下部分鲜质量促进率=(处理组根系质量-对照组根系质量)/对照组根系质量×100%。

2　结果与分析

2.1　不同木霉菌株对黄瓜枯萎病菌的竞争作用

平板对峙试验显示，4株木霉菌对黄瓜枯萎病菌均表现竞争作用。和对照相比，同一PDA平板上接种木霉菌后明显限制黄瓜枯萎病菌的菌丝扩展，培养后期木霉菌甚至可在黄瓜枯萎病菌的菌落上生长，并逐渐覆盖病菌。第5天测量结果表明，TH菌株竞争作用最强，菌丝扩展抑制率为67.70%，显著高于其他菌株；其次是TV和TL菌株，抑制率分别为54.44%和54.05%；TK竞争作用最小，抑制率为43.77%(图1)。

图1　不同木霉菌株对黄瓜枯萎病菌的竞争作用Fig.1　Competition action of different Trichoderma strains with F.oxysporum

2.2　不同木霉菌对黄瓜枯萎病菌的重寄生作用

观察发现，不同木霉菌的菌丝能够以多种方式寄生于病原菌的菌丝上，沿黄瓜枯萎病菌菌丝生长，并吸附于黄瓜枯萎病菌丝。其中TL和TH菌株的重寄生作用最强。如与病原菌紧贴或者缠绕在一起(图2-A，2-B)，或穿透病原菌菌丝在其内部生长(图2-C)。当木霉菌寄生在病原菌菌丝上时，导致病原菌菌丝发育受到影响，具体表现为病原菌菌丝断裂，细胞膨大或者萎缩，细胞内容物外泄等(图2-D)。

a.黄瓜枯萎病菌的菌丝　Hyphae of F.oxysporum ；b.木霉菌的菌丝　Hyphae of Trichoderma

2.3　不同木霉菌代谢产物对黄瓜枯萎病菌的生物活性

2.3.1抗生活性从图3可以看出，培养3 d后在加有黄瓜枯萎病菌的平板上牛津杯周围均出现清晰的透明圈，说明4株木霉菌株对黄瓜枯萎病菌病原菌均有抗生活性。其中TH菌株抗生活性最强，抑菌圈直径达到3.9 cm，其次是TL和TV菌株，TK菌株抑菌圈直径最小，抗生作用最弱。

2.3.2对菌丝生长的抑制作用由图4可知，不同木霉菌株的代谢产物对黄瓜枯萎病菌菌丝生长均表现抑制活性。其中TH和TL菌株代谢产物抑制作用最强，抑菌率分别为57.19%和51.61%，二者差异不显著；其次是TV菌株。TK菌株代谢产物抑菌作用最差，抑制率仅为4.69%，显著低于其他3个菌株。

图3　不同木霉菌对黄瓜枯萎病菌的抗生作用Fig.3　Antibiotic effect of different Trichoderma strains against F.oxysporum

2.3.3对分生孢子萌发的抑制作用供试木霉菌的代谢产物均显著抑制黄瓜枯萎病菌分生孢子的萌发，不同菌株抑制作用表现一定差异。TH和TL菌株抑制作用最强，抑制率分别达到68.35%和62.69%；TV菌株代谢产物对孢子萌发的抑制率为47.51%，TK的抑制率为34.15%(图5)。

2.4　不同木霉菌对黄瓜枯萎病的防病作用

盆栽试验结果表明，育苗时施用木霉菌株不同程度控制苗期黄瓜枯萎病的发生，TH菌株防病作用最强，防效达到64.34%，显著高于其余木霉菌株。从表1可以看出，供试的木霉菌株还对黄瓜根系和植株生长有一定促进作用，木霉菌对幼苗生长的促进作用和对病害的防治作用并不一致。TV菌株对黄瓜生长促进作用最强，地上部分和地下部分鲜质量分别增加42.81%和86.92%，防病作用最差的TL菌株对黄瓜生长促进作用仅次于TV菌株。

图4　不同木霉菌株代谢产物对黄瓜枯萎病菌丝生长的抑制作用Fig.4　Inhibition effect of different Trichoderma strains on mycelia growth of F.oxysporum

图5　不同木霉菌株对黄瓜枯萎病菌孢子萌发的抑制作用Fig.5　Inhibition effect of different Trichoderma strains on spore germination of F.oxysporum

处理菌株Treatment病情指数Diseaseindex防效/%Controlefficiency地上部分鲜质量/gFWofovergroundpart促进率/%Promotionrate地下部分鲜质量/gFWofundergroundpart促进率/%PromotionrateTL17.73±0.266.34d25.02±0.2826.75b1.95±0.0350.00bTV9.94±0.3247.49b28.19±0.1142.81a2.43±0.0686.92aTH6.75±0.2364.34a22.99±0.0716.46c1.62±0.0324.62cTK15.66±0.4117.27c20.80±0.185.37d1.54±0.0518.46dCK18.93±0.23-19.74±0.04-1.30±0.06-

注：同列中不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:Different letters in the same column indicate significant difference(P<0.05).

3　结论与讨论

木霉菌作为防治植物病害理想的生防因子，其对植物病原菌的拮抗机制主要包括竞争作用、重寄生作用、分泌具有活性的代谢产物、诱导宿主植物的自体抗性等[9]。竞争作用主要表现对生存空间和营养的竞争。试验发现4种木霉菌株生长速度均较快，生长速度明显快于黄瓜枯萎病菌，木霉菌甚至还可在黄瓜枯萎病菌的菌落上生长，并逐渐覆盖病菌，最终占领整个生存空间和营养空间，完全抑制病原菌的生长繁殖。这与Sivan等[10]及Barak等[11]的研究结果基本一致，但其在植物表面或侵入位点上能否迅速占领空间阻碍病原菌的侵染还有待通过植株栽培试验来进一步验证。供试的4种木霉菌因其生长速度存在差异导致其在对峙培养中表现的竞争作用不同。

木霉的重寄生作用包含对病原菌的侵染、识别、接触、缠绕、穿透和寄生等一系列过程[12]。供试的4种木霉，长枝木霉TL菌株和哈茨木霉TH菌株观察到明显的重寄生现象，菌株能够通过紧贴、缠绕、穿透等方式寄生于黄瓜枯萎病菌菌丝，引起病原菌菌丝断裂，细胞内容物外泄。木霉能否对植物病原真菌具有寄生作用可能与木霉是否产生能降解这种病原菌的细胞壁降解酶有关。

抗生作用是木霉发挥生物防治功能的重要机制[13]。木霉在代谢过程中可以产生抗菌物质阻止病原菌的定殖和抑制植物病原菌的生长而发挥其生防作用[14]。试验中观察到供试木霉菌的无菌代谢产物在加有指示菌的培养基上均能产生抑菌圈，而且能够抑制黄瓜枯萎病菌的菌丝生长和孢子萌发，证明木霉菌在生长过程中产生抗菌物质。不同木霉菌抗生作用不同，可能与产生抗生素的种类和数量有关。

盆栽试验中哈茨木霉TH菌株的防病效果最理想，这个研究结果与体外作用机制研究时该菌株对黄瓜枯萎病菌的拮抗作用最强相一致。生防菌作用效果与菌株类型、病原真菌的类型，作物类型和环境条件密切相关。木霉对植物病原菌的生物防治机制具有多样性和复杂性，往往是多种机制共同作用的结果，而不同菌株的生防机制的侧重点不同。深入研究木霉的生防作用机制有助于筛选高效的木霉菌株，从而有效控制植物真菌病害的发生。

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