女贞子提取物对大强度耐力训练力竭后大鼠肝组织自由基代谢的影响

张　辉

(南京审计大学体育部，江苏　南京　211815)

女贞子具有补肾滋阴、养肝明目的药理作用〔1〕。女贞子果实中含有多种抗氧化活性物质，易溶于乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂，并且可间接影响机体的自由基代谢活动，其中齐墩果酸是其中最主要的脂溶性抗氧化物质〔2〕。女贞子既往研究多针对女贞子提取物对机体的抗氧化效应〔3，4〕，对自由基代谢影响的研究还尚未深入。本研究主要探究女贞子提取物对大强度耐力训练力竭后大鼠肝组织自由基代谢的影响。

1　材料与方法

1.1实验小鼠随机选取SD雄性8周龄大鼠45只，体重(20.00±5.32)g，动物饲养房温度为(23 ± 5)℃，相对湿度为50%～70%，由专业饲养员进行饲养，提供正常的饮用水和饲料，适应性饲养7 d后进行耐力训练。

1.2女贞子活性物质的提取女贞子采自陕西，经中国科学院植物研究所鉴定。活性物质提取步骤：将采摘的女贞子果实洁净晾干后放于恒温烘箱中烘干，用研钵粉碎过40目筛后存放在干燥处备用。称取果实研碎粉末30 g置于锥形瓶中，按固液比1∶10的比例分别加入95%乙醇，同时采用静置、搅拌、加热回流等手段使溶剂与原料充分接触。最后，经长时间浸泡使原料中的化学成分溶解于溶剂中。

1.3实验动物分组及训练在耐力训练前将45只大鼠随机分为安静组、运动组、实验组各15只。耐力训练前，分别给安静组和运动组小鼠灌胃1 ml生理盐水，给实验组大鼠灌胃1 ml女贞子提取物，每天1次，持续7 d。之后对运动组和实验组小鼠进行6 w的耐力训练，每天训练前以15 m/min的速度做适应性运动5 min后再进行正式训练，训练模型根据实际情况调整的Bedford模型〔5〕。安静组小鼠不做处理，继续适应性喂养，保持正常的生理活动。

1.4制备大鼠肝组织样本经过6 w耐力训练后，断头处死大鼠，取大鼠肝脏后用滤纸吸干，称重，将大鼠肝脏研磨制备10%匀浆液，4℃，3 500 r/min离心5 min，取上清液，置于4℃冰箱保存待测。

1.5活性物质检测

1.5.1黄嘌呤氧化酶法测超氧化物歧化酶(SOD)活性〔6〕准备好测定管和对照管，在测定管中加好试剂和待测样品，对照管中不加任何待测样品。黄嘌呤氧化酶法试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，测定操作方法遵照试剂盒说明书。用漩涡振荡器充分混匀，置37℃水浴30 min。在两管中分别加入1ml显色剂，混匀，室温放置10 min，蒸馏水调零，测A530。SOD活力(U/ml)=(A2-A1)/A2×100%÷50%×反应体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数，A1：测定管的吸光值；A2：空白管的吸光值。

1.5.2Fe2+与菲啉类物络合法测定总抗氧化能力(T-AOC)〔7〕T-AOC检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。对照说明书在试管中加入相应试剂和100 μl肝组织匀浆，漩涡混匀器混匀，37℃水浴30 min，加入蒸馏水100 μl，测其吸收度。对照试管中加入相应试剂后加入100 μl蒸馏水，测其吸光度。T-AOC=(测定管OD-对照管OD)/0.01/30×稀释倍数。

1.5.3钼酸铵法测定过氧化氢酶(CAT)活性〔8〕配制65 mmol/L H2O2基液(过氧化氢酶测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供)。CAT检测：设置空白管、自身对照管、测定管，空白管中只加入CAT Assay buffer和65 mmol/L H2O2基液，自身对照管和测定管中则加入待测样品和65 mmol/L H2O2基液。立即混匀，置于水浴，准确孵育。每管中加入1 ml MO显色液。分光光度计检测405 nm处吸光度。组织样品CAT活力(U/mg)=〔(A自身对照-A测定)/A测定〕×650/待测样品血红蛋白浓度(mg/ml)。

1.5.4TBA比色法测丙二醛(MDA)含量〔9〕将上述上清液用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织细胞内的MDA含量。MDA检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。提前配制TBA工作液置于4℃避光保存。在离心管加入匀浆上清液、裂解液、磷酸盐缓冲液(PBS)、生理盐水等适当溶液做空白对照(注意：待测样品为血清、血浆时，标准品应用生理盐水稀释；待测样品为匀浆液时用相同溶液稀释)。随后加入4.14 ml MDA检测工作液。将上述试剂混匀，水浴煮沸。水浴冷却至室温，离心。取上清，蒸馏水调零，用分光光度计或酶标仪检测523 nm或535 nm处吸光值。MDA浓度(μmol/mg)=(OD测定-OD空白)/(OD标准-OD空白)×10蛋白质质量浓度(mg/ml)。

1.5.5比色法检测大鼠肝组织乳酸脱氢酶(LDH)活性〔10〕丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴中预热。取一只比色杯中加入磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，置于紫外分光光度计中，在340 nm处将光吸收调节至零。取另一只比色杯用于测定LDH活性，依次加入丙酮酸钠溶液和NADH溶液，加盖摇匀后，测定340 nm吸光值(A)。随后，取出比色杯，加入经稀释的酶液10 μl，摇匀，每隔5 min测A340 nm。LDH活力(U/ml)=(A340 nm×稀释倍数)/(酶液加入量)×10-1。LDH活性检测采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒。

1.6统计学方法采用SPSS22.0软件进行方差分析。

2　结　果

2.1各组体质量、力竭时间及肝组织质量的变化比较注射女贞子提取物或耐力训练后，相对安静组，运动组力竭游泳时间和体质量增加，但差异无统计学意义(均P>0.05)。而运动组肝组织质量相对安静组增加显著(P<0.05)。实验组力竭游泳时间和体质量相对安静组、运动组显著增加(均P<0.05)，肝组织质量虽有增加，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　各组体质量、力竭时间变化比较

与安静组比较：1)P<0.05；与运动组比较：2)P<0.05；下表同

2.23组各指标活性变化运动组SOD、T-AOC、CAT活性相对安静组有一定下降，差异有统计学意义(P<0.05)，而MDA、LDH活性有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。实验组SOD、T-AOC、CAT活性相对安静组、运动组有一定提高，MDA、LDH活性有所下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2　女贞子提取物对实验大鼠肝组织SOD、T-AOC、CAT、MDA、LDH活性的影响

3　讨　论

机体日常生命活动过程中会产生大量的自由基，尤其在进行耐力运动后，自由基过多对人体造成一定副作用〔11〕，其对人体的攻击首先从细胞膜开始，细胞膜极富弹性和柔韧性，电子极容易丢失，细胞膜弹性及其相关功能均随之丧失。由于细胞生理结构遭到破坏，机体就会出现各种疾病〔12〕。此外，自由基还会攻击蛋白质并对基因进行破坏，参与机体生命活动的蛋白质酶类遭受侵袭导致机体代谢紊乱，进而导致基因突变。

本研究显示运动和服用女贞子提取物均能影响机体参与自由基代谢相关酶类的活性，从而间接影响大鼠肝组织的自由基代谢反应。SOD是一种源于生命体的活性物质，是一种很好的抗氧化物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，人体不断补充SOD会有一定的抗衰老效果〔13，14〕。T-AOC反映机体的总抗氧化能力，代表体系中大小分子和酶总和的水平，适当运动背景下，机体自由基代谢处在相对平衡的状态，SOD活性和T-AOC会得到加强，但耐力训练之后机体自由基代谢紊乱，活性和抗氧化能力自然会有所下降。CAT是一类催化能力极强的过氧化氢酶和氧化还原酶，以铁卟啉为辅基，CAT能催化体内的过氧化氢分解反应，能清除自由基〔15，16〕，在维持细胞氧化与抗氧化活性物质的平衡上具有重要意义。耐力运动后，CAT活性减弱，这可能是由于力竭运动后机体产生了过量的过氧化氢，而过氧化氢能与CAT的-SH结合，从而消耗大量的CAT，破坏了细胞氧化与抗氧化的平衡。在小鼠或人体中，氧自由基反应和脂质过氧化反应在机体代谢中起着重要作用，脂质过氧化反应会形成脂质过氧化产物如MDA等，MDA是机体发生脂质过氧化反应的产物，其含量可反映脂质过氧化程度，同时也反映了细胞的受损程度〔17〕，力竭运动后，MDA含量相对有所上升，说明机体发生了大量的过氧化反应，这可能是因为机体由于自由基代谢紊乱，抗过氧化酶类活性下降，增强了机体的过氧化反应。LDH是一种糖酵解酶，存在于机体所有组织细胞的胞质内，是机体内无氧呼吸过程的主要酶类，与无氧运动有关，耐力运动后，LDH活性上升，主要是因为耐力运动过程中进行无氧呼吸，产生了大量的乳酸原因。

女贞子含有多种抗氧化活性物质，以齐墩果酸抗氧化功能尤为显著〔18〕，齐墩果酸是一种齐墩果烷型五环三萜类化合物，存在于大量饮食和药用植物中，具有抗氧化、抗感染、保护心脏、抗菌、抗病毒的药理作用。给大鼠灌服女贞子提取物后，在进行耐力运动的过程中产生了大量的自由基，由于女贞子提取物中含有大量的抗氧化物质，阻碍了机体发生氧化反应，同时也可清除运动过程中产生的大量自由基，维持了机体氧化与抗氧化的平衡，使得自由基代谢能够有条不紊进行。本研究结果显示，女贞子提取物可维持机体自由基代谢的平衡，提高机体的抗氧化能力，提取物中的抗氧化活性物质除了可以起到抗氧化的作用外还有许多的药理作用，能控制人体其他的病理过程，具有比较好的保健作用。

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