普奈洛尔抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞生长机制的实验研究

徐永飞　武海龙　赵哲媛　石英光

[摘要]目的：探讨普奈洛尔抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的机制。方法：选择本院瘢痕疙瘩患者病理组织，分离培养，获取成纤维细胞，并分别于含有普萘洛尔的培养基（实验组）和单纯培养基（对照组）中进行培养，应用CCK-8法检测两组瘢痕疙瘩成纤维细胞生长曲线，酶标仪检测450-630nm的吸光度值。结果：实验组瘢痕疙瘩成纤维细胞生长能力明显受到抑制，且吸光度值明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：普萘洛尔可明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长，为整形外科中瘢痕疙瘩的预防及治疗提供了新方向。

[关键词]瘢痕疙瘩；成纤维细胞；普萘洛尔；生长曲线

[中图分类号]R619⁺.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）02-0091-03

瘢痕疙瘩常继发于皮肤伤口的不良愈合，不仅影响美观，常可伴发局部感觉异常，严重者甚至可形成局部破溃，严重影响患者身心健康。普萘洛尔常用于整形外科中血管瘤的治疗，其在抑制血管瘤侵袭性生长方面，疗效显著。基于此，DE Mesquita CJ曾大胆假设将普萘洛尔应用于瘢痕疙瘩的治疗，并做了大量的临床实验。本研究主要从普萘洛尔对瘢痕疙瘩的生物学特性方面出发，明确其影响瘢痕组织成纤维细胞生长的作用机制，现报道如下。

1材料和方法

1.1实验药品及试剂：盐酸普萘洛尔片（东北制药生产，批准文号：国药准字HP1021682），PBS液，0.075%Ⅱ型胶原酶，10%FBS，低糖DMEM，胎牛血清，DMEM培养基，青链霉素，0.25%胰蛋白酶，二甲基亚砜（DMSO）溶液，PBS溶液。

1.2瘢痕疙瘩组织：瘢痕疙瘩组织来源于本院整形外科瘢痕疙瘩切除患者，并经病理证实，且所有患者对本研究知情并签署相关知情同意书。纳入标准：①患者6个月内病变组织无破溃、感染及癌变等；②患者6个月内未口服抗瘢痕药物或激素类药物；③患者6个月内未接受放射治疗；④无精神性疾病及相关器质性疾病者。

2方法

2.1瘢痕疙瘩成纤维细胞的制备：用PBS液冲洗所获取的脂肪组织，用Ⅱ型胶原酶消化获取脂肪颗粒，过滤上清液及未消化的脂肪组织，并放入离心机中以1200r/min离心10min，得到单核细胞，调整细胞浓度至104个细胞/ml，进行培养，获取所取种子细胞，并进行免疫鉴定。

2.2实验分组：根据培养基不同，将实验分为2组，实验组为含有50ng/L普萘洛尔的培养基；对照组为单纯培养基。将获取的瘢痕疙瘩成纤维细胞分别放入两组培养基中进行培养，48h后，两组培养基中分别加入10ul的CCK-8液，继续培养24h。

2.3检测指标：使用酶标仪检测两组瘢痕疙瘩成纤维细胞生长因子450～630nm的吸光度值，吸光度值越高，表明瘢痕成纤维细胞增殖能力越强；并连续检测其7d生长曲线，从而明确普萘洛尔对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长能力的影响。

2.4统计学分析：数据采用SPSS 18.0统计软件进行分析。采用LSD-t检验进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1瘢痕疙瘩成纤维细胞鉴定结果：利用免疫细胞化学技术，可见瘢痕成纤维细胞表面标记物CD73、CD90及CD105均为阳性，表达率较高，说明细胞具有成纤维细胞特性。结果见图1。

3.2一般形态学观察：实验组细胞数目较少，体积较小，排列疏松，呈梭形或长方形，核小，轮廓清晰；对照组细胞数目较多，体积较大，排列紧密，呈突出的纺锤形或星形扁平细胞，核大，轮廓清晰。

3.3两组瘢痕成纤维细胞吸光度值检测结果：实验组瘢痕成纤维细胞吸光度值明显小于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），观察组瘢痕成纤维细胞增殖能力较差。见表1。

3.4两组瘢痕成纤维细胞生长曲线：两组细胞总体生长趋势大致相同，第1～2天生长缓慢，第3～4天生长迅速，第5天达到高峰，第6～7天相对平稳，形成一个平台期。实验组细胞生长能力明显低于对照组。见图2。

4讨论

瘢痕疙瘩与普通瘢痕不同，常突出于体表，且不稳定，不仅影响美观，甚至局部可出现疼痛、瘙痒等不适症状，影响工作和休息，其无法自行消失，长期存在可发生破溃，严重影响患者身心健康。目前国内外学者比较认可的发病机制是组织细胞的功能异常，即成纤维细胞的过度增殖，成纤维细胞是瘢痕疙瘩发生的始动细胞，也是形成肉芽组织、合成胶原等细胞外基质、进行伤口重塑的重要细胞，它通过活化、增殖、合成胶原来修复创面，可一旦成纤维细胞的功能发生异常将导致瘢痕疙瘩的形成。瘢痕疙瘩的治疗是临床上的难题，单一的治疗方法效果差，临床上治疗瘢痕疙瘩的方法有手术切除、放疗、局部注射药物、激光治疗、压力疗法以及联合治疗等，国内外学者一致认为联合疗法的效果较单一疗法好。目前瘢痕内注射药物在治疗瘢痕疙瘩中起到了重要作用。因此对于瘢痕疙瘩，早期干预，使瘢痕疙瘩丧失生长的始动力，尤为重要。

普萘洛尔最早应用于整形外科中婴幼儿血管瘤的治疗，其机制可能与抑制血管瘤成纤维细胞生长因子有关，研究发现，普萘洛尔作为常用的β受体拮抗剂，具有抑制胶原蛋白形成、抗纤维化作用，其作用机理是通过竞争性抑制TGF-β、受体，从而抑制了成纤维细胞的生物学活性，减少胶原分泌，达到抗纤维化的效果。

本研究探讨了普耐洛尔抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞生长，从而抑制瘢痕疙瘩生长，实验标本来源于本院瘢痕疙瘩患者，并经病理证实，采用中性蛋白酶消化分离瘢痕表皮细胞，避免表皮细胞对实验结果带来干扰，进一步传代培养，将所获得的种子细胞应用其特异性标志物进行鉴定，从而保证实验结果的准确性。将含有50ng/L普萘洛尔的培养基作为实验组，对照组选用单纯培养基，通过绘制两组瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长曲线，并测定第1～7天吸光度值来反应瘢痕疙瘩成纤维细胞的生長能力，结果发现，实验组与对照组瘢痕疙瘩成纤维细胞均呈S形生长，但实验组细胞生长能力明显低于对照组，且实验组瘢痕疙瘩成纤维细胞吸光度值明显低于对照组，进一步证明，普萘洛尔可在一定程度上抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长，从而抑制瘢痕疙瘩的生长及其纤维化，为临床上瘢痕疙瘩的预防及治疗提供了新方向，但本研究仅仅通过细胞方面的基础研究提供理论支持，要全面应用于临床，有待于进一步的临床实验研究。

[收稿日期]2017-09-27 [修回日期]2017-11-20

编辑/朱婉蓉