HBP表达水平对脓毒症的预警评估作用研究进展

孔丽蕊，黄深华，黄亨建

(1.成都市郫都区中医医院,四川 成都,611730; 2.四川大学 华西医院,四川 成都,610041)

脓毒症是指宿主对感染反应失调引起的致命性的器官功能障碍[1]，是导致重症感染患者死亡的主要原因，是人类健康的重大威胁之一。按严重程度分为脓毒症、严重脓毒症和脓毒性休克。肝素结合蛋白是一种多功能蛋白，具有杀菌功能和趋化特性，在脓毒症的发生、发展中起重要作用。文中将对HBP的结构特点、分泌表达及其对脓毒症的早期预警、预后评估作用进行阐述。

1 HBP结构特点

HBP是一种存在于多形核白细胞(human polymorphonuclear leukocyte，PMN)颗粒中的多功能炎症介质。1984年，作为中性粒细胞内对具有杀灭革兰阴性菌和白色念珠菌活性作用的蛋白质被Shafer等[2]首次发现并分离成功，因其具有杀菌活性，相对分子量为37000，被命名为阳离子抗菌蛋白37(cation,ic antimicrobial protein of 37000，CAP37)。后来，Gaday等[3]从多形核白细胞颗粒中成功分离出具有杀菌活性的嗜苯胺蓝蛋白，将其命名为天青杀素(Azurocidin)。1991年，Flodgaand等[4]又从人和猪的多形核白细胞颗粒中分离出具有强结合肝素能力的蛋白，因其特殊结构带有正电荷，与肝素有极高的亲和力，将其命名为肝素结合蛋白。通过蛋白及相关基因测序证实，CAP37、天青杀素、HBP三者为同一种蛋白。

未成熟的HBP由251个氨基酸组成。在合成单链糖蛋白过程中，N末端去除26个氨基酸残基，C末端去除3个氨基酸残基，导致HBP失去蛋白酶的活性[5]，变为由222个氨基酸残基构成的成熟HBP分子。成熟HBP分子与人中性粒细胞弹性蛋白酶有45%的同源性，因其结构上有一个催化作用的三联体，使HBP41位的组氨酸残基和175位的丝氨酸残基被丝氨酸和甘氨酸替代，在分子表面形成独立的板块[6]，致其无法与二异丙基氟磷酸结合而失去蛋白酶的活性。 重组HBP分子上具有催化作用的三联体，三联体是由两个类似胰蛋白酶的蛋白酶类区域组成的，这两个区域是由6个反向平行的β氨基酸组成的β圆柱形，仍具有与胰蛋白酶抑制剂(BPTI)结合的活性。另外，HBP序列还与人的中性粒细胞弹性蛋白酶有45%的同源性，与蛋白酶3有42%的同源性，与组织蛋白酶G有32%的同源性[7]，它们同为丝氨酸蛋白酶家族的成员，具有蛋白消化、免疫调节、激活激素等生理功能[8]。同时，HBP蛋白序列中第20-44位氨基酸残基组成的V型疏水结构，对脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)脂质A具有高亲和力而获得结合内毒素的能力[9]。LPS是全身炎症反应的重要触发剂，通过LPS受体刺激多种细胞，释放、表达多种细胞因子，发挥其毒性作用[10]。

2 HBP的表达机制

2.1 HBP的释放机理

HBP存在于多形核白细胞嗜苯胺蓝颗粒和分泌颗粒中[11]，正常人含量极低，一般不超过10ng/ml。一旦机体发生感染，菌体或细菌释放毒素进入血液循环，激活体内中性粒细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞等多种炎性介质释放HBP。目前报道的HBP释放机制有：1)化脓性链球菌细胞壁表面的M1蛋白进入血液与纤维蛋白原结合形成复合物，再与多形核白细胞表面β2整合素结合，诱导PMN释放HBP[12]；2)溶血性链球菌产生链球菌溶血素(streptolysin O，SLO)，SLO是一种含-SH的蛋白质，对中性粒细胞通过毒力穿孔破坏细胞，致细胞钙离子内流，激活p38-丝裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)信号通路，使效应细胞表达、合成、释放IL-1、IL-8、肿瘤坏死因子α(Tumour necrosis factor-α，TNF-α)等多种炎性细胞因子及花生四烯酸产物，产生炎症反应，诱导PMN释放HBP[13]； 3)A族β溶血性链球菌引起真皮细菌感染，导致炎症蔓延，通过局部激活人体接触系统导致HBP释放[14]；4)中性粒细胞表面胰蛋白酶抑制剂(BLT1)与花生四烯酸代谢产物白三烯(LTB4)结合，激活细胞内磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路，诱导HBP释放[15]； 5)LPS刺激单核细胞分泌少量HBP[16]。

2.2 HBP的作用机制

血管内皮细胞是HBP释放表达后第一个靶细胞。HBP分子带有大量正电荷，与血管内皮细胞表面带负电荷的多糖包被结合[17]，激活细胞内小G蛋白家族的Rho信号通路[18]，引起肌球蛋白轻链激酶/肌球蛋白轻链(MLCK/MLC)磷酸化，内皮细胞内Ca2+激活，形成肌动蛋白张力纤维，导致内皮细胞骨架重排，内皮细胞形态改变，细胞屏障破坏，通透性增强，细胞旁通路渗漏，细胞内大分子物质流出[19]。血浆漏出的同时多形核白细胞移行到组织并脱颗粒，释放大量HBP，导致单核/巨噬细胞的趋化与激活[20]。

Rasmssen等[21]发现HBP能激活单核/巨噬细胞，使其分泌炎症介质和相关分子表达上调，吞噬和直接清除杀伤细菌，还能合成和释放非特异性炎性介质调节免疫功能[22]。这些细胞因子以旁分泌的形式激活第二信使，改变相关基因表达进而改变靶细胞行为。经孵育后的巨噬细胞，其人白细胞抗原Ⅱ(HLAⅡ)、CD40、CD86表达增加[23],白细胞IgG受体(FcγRs)、CD64、CD32表达上调，释放TNF-α、IFN-α等炎症介质[24],扩大相关炎症反应。

另有研究[25]证实HBP进入细胞后聚集在线粒体区域，通过线粒体途径调节细胞凋亡。HBP分子带有大量正电荷，能被线粒体外膜转位因子及内膜转位因子(TOM/TIM)识别并允许通过进入线粒体[26]，引起人脐静脉内皮细胞(HUVECs)内线粒体形态学异常，膜电位下降，氧代谢关键蛋白CoxⅡ基因表达下调，从而抑制线粒体氧代谢功能[27]。

3 HBP在脓毒症中的评估预警作用

脓毒症是指由感染导致的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response sydrome，SIRS)[28]。机体感染时血浆外渗，中性粒细胞聚集到感染部位，进一步加重导致SIRS，发展为脓毒症，脓毒症进一步发展出现循环和细胞/代谢失调，最后导致脓毒性休克[29]。《中国严重脓毒症/脓毒性休克治疗指南(2014)》[30]指出，肝素结合蛋白(HBP)可作为脓毒症，特别是严重细菌感染的一种早期诊断标志物。

3.1 HBP早期预警价值

炎症反应早期，血浆外渗、中性粒细胞趋化、游走、激活引起的病理生理过程是造成血管内皮细胞损伤的始动因素[31]，大量研究[32-33]证实脓毒症患者HBP水平表达高于非脓毒症组。Akesson等[34]发现338名脓毒症患者HBP水平在血压降低前已明显高于对照组，143名严重脓毒血症患者血浆HBP浓度大于30ng/ml时，平均在10.5h后80%的患者出现器官衰竭。这些特征，凸显了HBP作为一种诊断工具的潜力。

陈琼娜等[35]通过收集诊断脓毒症的时刻0h、前24h、前48h、前72h HBP检测水平发现，诊断脓毒症0h、前24h、前48h、前72h时的敏感度和特异度分别为90.7%和84.2%、90.7%和65.8%、83.7%和63.2%、83.0%和42.3%，HBP从脓毒症早期至脓毒症诊断前72h就存在较佳的诊断效能，其诊断窗口期一直延续至脓毒症诊断成立时刻。冯敏[36]等在探讨HBP的诊断学价值的过程中也发现，HBP对脓毒症的灵敏度或者特异度的表达均在85%以上，对脓毒症的早期诊断具有一定的参考价值。

3.2 HBP评估预测作用

脓毒症是导致重度感染患者死亡的主要因素。Kumar等[37]证实脓毒症休克患者，血压下降与抗生素使用之间的时间与患者病死率密切相关。脓毒症发生时，中性粒细胞被菌体、毒素及凝血因子复合物等激活[27,38]，粘附于血管内皮细胞释放HBP[39]，激活Ca2+，血管通透性增加，大分子物质渗漏及组织损伤[16，40]，炎症反应持续发生，从而破坏内环境的稳定性，进一步导致细胞缺氧、有效循环血容量降低、机体器官功能衰竭、死亡，引起低血压甚至休克。

朱宏坤[41]研究发现，血浆HBP与脓毒性休克的发生及疾病严重程度有关，与器官功能障碍数目多少关系不大，说明HBP参与了内皮细胞功能障碍和毛细血管渗漏机制,具有很强的致血管渗漏作用,HBP能特异性地作用于循环血管，但不参与多器官功能障碍的炎症打击反应机制，可以作为预测疾病预后、评估病死率的指标。Linder等[34]对ICU病房中严重败血症或脓毒性休克患者的监测发现，HBP水平与病情严重性息息相关，HBP随着病程延长而上升是病情恶化的一种预兆，HBP含量较高的患者有更高的死亡风险。

刘杨等[42]研究血浆HBP在脓毒症休克中的预测作用中时发现，脓毒症患者HBP水平明显高于非脓毒症患者，休克组脓毒症患者HBP水平高于非休克组脓毒症患者，HBP预测脓毒症休克时较传统指标乳酸和APACHEⅡ评分有优势，是良好且特异性的脓毒症休克发生和脓毒症患者死亡的早期预测指标。

4 结语

临床上用于判断感染的炎症指标很多，其升高水平不一定能准确反映病情的严重程度。研究证实[43-44]，白细胞(WBC)、C反应蛋白(CRP)等缺乏特异性，无法反映预后，降钙素原(procalcitonin ，PCT)有助于诊断脓毒症及评判脓毒症的严重程度，只在机体感染产生全身反应时才会产生，局部感染或慢性感染时血清水平正常或轻微升高[45]，不能有效区分是细菌感染还是非细菌感染所引起的SIRS[46]。 HBP作为一种颗粒释放蛋白，与细菌感染有紧密的关系，作为临床新型炎症标志物，HBP存在较宽的窗口期，具有早期、特异、敏感的特性，优于传统的炎症标志物[47-48]，且对脓毒症的早期预警、预测评估及疗效观察具有特异性的临床价值。但有关HBP在体内产生和释放机制及临床应用方面的研究尚存在许多空白点，仍需进一步探索研究。