药用蕨类植物蛇足石杉的研究进展

(上饶师范学院 生命科学学院，江西 上饶 334001)

蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb.ex Murray)Trev.)为蕨类植物门石松亚门石松目石杉科石杉属草本植物[1]。蛇足石杉一般生长于位于300～270 0 m海拔的林荫湿地下、灌丛下、路旁或沟谷石上[2]。在我国蛇足石杉主要分布于江西、浙江、福建、两广等地区[3]。蛇足石杉也称为千层塔、蛇足草、金不换、山芝、千金榨等，是我国一种传统的药用蕨类植物[4]。蛇足石杉可以干燥全草入药，味苦、辛、微甘，性平，归肺、大肠、肝、肾经，具有清热解毒、生肌止血、散瘀消肿等功效，民间用于治疗跌打损伤、瘀血肿痛、内伤出血、肿痈疔毒、毒虫叮咬、烧伤烫伤等症[5]。蛇足石杉的主要药用成分为石杉碱甲[6]，对乙酰胆碱酯酶有强效、低毒、可逆的抑制作用还能减少可溶的β淀粉体和减缓淀粉样蛋白空斑的形成，可有效提高和改善老年记忆，可用于治疗重症肌无力、中老年痴呆等，且作用时间长，安全指数大，稳定性好，不良反应小等[7]。目前，石杉碱甲在生物制药领域备受关注，被美国FDA誉为第二代胆碱酯酶抑制剂之一[8]。石杉碱甲的生产大多以野生蛇足石杉为原材料，据统计，每提取 1 kg的石杉碱甲，需消耗掉将近104kg的野生蛇足石杉[9]，对野生蛇足石杉的消费巨大。野生蛇足石杉资源的短缺使得药材价格暴涨[10]。但在自然条件下，蛇足石杉植株十分矮小，生长极其缓慢，每年生长速度约2.0～3.0 cm，难以满足巨大的药材市场需求。因此，保护野生蛇足石杉资源已是当务之急、重中之重。

有关蛇足石杉的研究目前报道极多，主要集中在生理生化指标、化学成分分析、内生真菌分离和鉴定、提取工艺、药理作用、新品种选育、遗传多样性、种群结构和地理分布、组织培养以及基因克隆、原核表达及其功能分析等。本文将从这些方面入手对蛇足石杉的研究进行概述，旨在为人类利用蛇足石杉提供一个初步认识，也为蛇足石杉的后续研究提供一个初步的框架。

1 生理生化指标

在生理生化指标方面，高温胁迫对蛇足石杉生理特性的影响[11]以及高温胁迫对蛇足石杉质膜透性和叶绿体结构的影响[12]多见报道。这些研究表明，温度的增加会促进蛇足石杉可溶性糖和游离可溶性脯氨酸含量显著提高，单可溶性蛋白质量以及POD和SOD活性显著下降；当温度为35 ℃和40 ℃时，蛇足石杉的MDA、电导率显著增加；透射电镜观察显示，35 ℃胁迫4 d，蛇足石杉叶绿体开始变形，40 ℃胁迫 4 d，蛇足石杉叶绿体结构被破坏，被膜开始断裂，类囊体的排列开始出现紊乱，基质的片层也出现断裂，形状变得不规则；因此，可以推测蛇足石杉最适合的生长温度约为25 ～30 ℃，35 ℃胁迫会抑制蛇足石杉生长，超过40 ℃的高温胁迫 4 d 会导致植株快速死亡；黎有有等[13]比较了蛇足石杉叶片在不同光照处理[弱光处理(两 层 遮 荫 网，RI 为10%)、中光处理(一层遮荫网，RI 为5%)、强光处理(大棚内光照条件，RI 为 100%)]下的气孔特征，结果发现，环境光强的增加均会导致蛇足石杉叶片气孔长度、宽度、单个气孔面积、气孔密度及气孔总面积等叶片生理指标的显著增加。

2 化学成分分析

胡莉琴等[14]建立了蛇足石杉内生真菌胶胞炭疽发酵液中石杉碱甲和石杉碱乙含量高效液相色谱(HPLC)测定法。李关艳和苏有勇[15]建立了石杉碱甲液相色谱串联质谱联用法(LC～MS)测定法，并指出不同产地的蛇足石杉叶和茎中的石杉碱甲含量具有显著差异，含量最高是云南玻璃温室种植的蛇足石杉，其次是江西蛇足石杉，第三是湖南蛇足石杉，福建蛇足石杉石杉碱甲含量较低。张方方等[16]建立了石杉碱甲UFLC测定法，同时指出蛇足石杉茎的石杉碱甲含量远远高于叶和根，而叶的石杉碱甲含量又高于根。王德立等[17]采集了江西修水县、贵州岑巩县、广西那坡县和重庆石柱县等 4 个样地中不同生长阶段的野生蛇足石杉进行HPLC 法测定，结果发现，蛇足石杉幼苗和蛇足石杉幼株有利于石杉碱甲含量的积累，其含量显著高于蛇足石杉成株，另外，这4个不同样地之间的石杉碱甲含量也存在差异，主要是因为生境因子严重所致，比如降雨较多对石杉碱甲的积累不利。何春萍等[18]采取4种方法(超声法、索氏法、酸浸法和煎煮法)提取贵州蛇足石杉的石杉总生物碱，结果发现，超声法对于石杉碱甲提取最为有利，其次是索氏法，较差的方法为酸浸法和煎煮法，同时利用超声提取法，叶的石杉碱甲含量最高，其次是茎，最低是根，这个结果表明蛇足石杉的地上部分不同，其石杉碱甲含量也不同。

3 内生真菌分离和鉴定

2015年，韩文霞等[19]通过薄层色谱(TLC)和HPLC法筛选并鉴定为一株产石杉碱甲的青霉菌属真菌；2016年，韩文霞等[20]同样采用TLC及HPLC法筛选并鉴定内生真菌NSG～1为1株尖镰孢(镰刀菌)属真菌尖镰孢NSG；2017年，韩文霞等[21]再次从野生蛇足石杉中筛选并鉴定产石杉碱甲内生真菌NSH～5为轮枝镰孢菌。于飞雪等[22]从内生真菌M336 发酵提取物鉴定出chaetoviridines F、chaetoviridines E、5'～epichaetoviridinA、5'～epichaetoviridin A、xanthoquinodins Al、xanthoquinodins A2、xanthoquinodins B1 和毛壳菌素8 个化合物，其中指出5'～epichaetoviridin A有抑菌作用，而其他7种化合物则具有一定的细胞毒活性。彭思露等[23]研究了蛇足石杉内生真菌Shiraiasp.Slf14 中III 型聚酮合酶的表达、纯化，并对其进行了生物信息学分析，成功构建了表达载体 p ET～22b(+)～PKSIII。陈艳梅等[24]以蛇足石杉为材料，从其茎部分离纯化得到1株内生真菌，提取这株真菌的总DNA，用PCR扩增ITS片段，将测序结果在GenBank数据库中进行比对，最终鉴定为葡萄座腔菌属。赖政等[25]发现蛇足石杉内生真菌菌株 SF88 和LF52在马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)、沙氏液体培养基(SDB)和查氏液体培养基(CDB)上发酵后其菌体总生物碱对乙酰胆碱酯酶(ACh E)活性的抑制率均达到40%～70%，经测序分析，可以认定SF88 和LF52为Phaeosphaeriaceae科中一未知种，这为开发生物碱类乙酰胆碱酯酶抑制剂(ACh EI)药物提供了新的潜在菌种资源。

4 提取工艺

杨婷等[26]和余宇燕等[27]分别建立了基于Box～Behnken提取石杉碱甲的最佳工艺和石杉碱甲免疫学快速检测的最佳工艺。而周宇等[28]认为蛇足石杉中总黄酮提取的最佳工艺条件为60%乙醇→90 min萃取→90 ℃加热→1:20(固液体积比)，在此条件下，总黄酮提取率可达到0.447%。

5 药理作用

蛇足石杉药理活性研究最为系统的成分是石杉碱甲(Hup～A)，其主要药理活性为抗ACh E作用。Hup～A 药理的研究表明，Hup～A可以影响脑内神经递质、兴奋性氨基酸及其 NMDA 受体，还可改善记忆认识损害，具有一定的药动学规律等[29-30]。另外，研究也表明，蛇足石杉中还存在另一个强效胆碱酯酶抑制剂，即6β～羟基石杉碱甲，其对ACh E的抑制作用强于Hup～A达 4 倍之多，但其毒性远远低于 Hup～A。还有研究表明，马尾杉碱 M 、异福定碱、2α,11α～dihydroxyfawcettidine 和 lycoposerramine H3C也具有较好的ACh E抑制作用[31-32]。Tan 等[33-34]研究表明，huperzine P、fawcettimine、phlegmariunine B 和 huperzine R 也具有一定的ACh E 抑制活性，但其活性没有 Hup～A 显著。

6 新品种选育

闫志刚等[35]通过系统选育，从广西 20 多个县市收集的 25 份蛇足石杉种质中筛选出一个蛇足石杉新品种——容杉2 号，这个品种含石杉碱甲高(质量比0.0714%)，且平均单株产量高(3.89 g)，这为我国蛇足石杉的品种选育指明了方向，也在一定程度上解决了野生蛇足石杉石杉碱甲含量不高的难题。

7 遗传多样性

林如辉等[36]引种了福建大田、三明市郊、南靖 3 个野生蛇足石杉种质资源，并对其进行驯化，最后采用HPLC法测定其石杉碱甲含量，结果表明，福建大田、三明市郊、南靖 3 个野生蛇足石杉种质资源共有 15 个差异蛋白质点，福建大田、三明市郊、南靖 3 个野生蛇足石杉种质资源的差异蛋白质点丰度差异显著。黄骥等[37]对武陵山区蛇足石杉4个居群进行遗传多样性AFLP分子标记分析，结果发现，武陵山区蛇足石杉遗传多样性较为丰富，其遗传变异主要来源于居群内，同时指出，蛇足石杉属于异交种，其居群间的遗传距离与地理距离之间无正相关。

8 种群结构和地理分布

齐耀东和王德立[38]分析了江西、贵州、广西、重庆及海南等5地蛇足石杉天然居群的种群结构、变化趋势及生长速率等，结果发现5地蛇足石杉天然居群结构较为相似，基本是以幼苗和幼株作为居群主要构成，居群内成株偏少；5地蛇足石杉天然居群的生长速率不具有显著差异，年生长量约为2.0～ 3.0 cm；海南居群芽胞可产生芽胞的幼苗和成株占居群的比例显著高于其它居群，说明海南蛇足石杉种群的结构更新主要是以芽胞繁殖为主，而江西、贵州、广西、重庆的蛇足石杉居群则是以孢子繁殖为主。潘丽梅[39]采用分段匀滑技术编制了广西大明山自然保护区蛇足石杉种群的静态生命表，并在此基础上对其进行种群生存分析，结果发现，广西大明山自然保护区蛇足石杉种群存活曲线趋于Deevey～Ⅱ型，且广西大明山自然保护区蛇足石杉种群生长过程中在第Ⅳ龄级具有一个死亡高峰。王德立等[40]通过查阅世界范围的植物志以及中国各大标本馆和中国植物志中有关蛇足石杉的文献资料，获取了世界范围内蛇足石杉的地理分布数据，明确了中国蛇足石杉主要分布于长江以南各省，东北地区仅有少量分布。周毅等[41]对湘西地区蛇足石杉资源进行了采样分析，指出蛇足石杉资源掠夺性采收以及其种群较低的自然更新频度是其种群动态平衡很难维持的主要原因，也是造成湘西地区蛇足石杉资源蕴藏量显著下降、种质资源大幅消失的主要因素，呼吁国家相关采取相关措施保护湘西地区蛇足石杉种质资源。杨伟波等[42]分析了蛇足石杉种群在湘西油茶树群落中的分布格局，结果发现，蛇足石杉种群在湘西油茶树群落中的分布格局类型大多是呈集群式分布，且符合n= 1的奈曼分布。

9 组织培养

有关蛇足石杉的组织培养报道较多。王锋和武芸[43]对恩施市长岭岗的蛇足石杉进行组培快繁体系的研究，结果表明，100 mg/L AAS+0.5 mg /L 孔雀石绿组合有利于抑制蛇足石杉外植体的内生菌，外植体的存活率可达20%；添加0.05μg/ L IBA、1.4μmol/ L KT、0.1 g/L谷氨酰胺、0.05%(质量浓度，下同)山农一号和0.3 mg/L TDZ的MS培养基有利于蛇足石杉的初代培养；添加1.0 mg/L TDZ和1.0 mg/L 2,4～D的MS培养基则可促进蛇足石杉继代培养中的愈伤组织诱导；添加1.5 mg/L IBA和2.0 mg/L 谷氨酰胺的1/3MS培养基有利于蛇足石杉的生根。叶丽婻等[44]发现，H2O2诱变后，蛇足石杉叶状体的石杉碱甲含量显著提高，并在此基础上筛选出蛇足石杉高产株系SH42。陈曼等[45]的研究表明，天冬氨酸有利于蛇足石杉叶状体干重生物量和石杉碱甲含量的显著提高；色氨酸有利于蛇足石杉叶状体相对增殖率的显著提高，但不利于蛇足石杉叶状体的石杉碱甲积累；赖氨酸则不利于蛇足石杉叶状体相对增殖量和干重生物量的增加，也不利于蛇足石杉叶状体石杉碱甲含量的积累，究其原因，可能是天冬氨酸可以促进蛇足石杉叶状体SOD酶活性的提高和叶状体石杉碱甲的积累量，但SOD酶活性的长期高水平保持则对叶状体石杉碱甲的积累不利。刘江海等[46]研究了蛇足石杉侧芽的发生及其培养，指出蛇足石杉在离体培养中不一定像自然生长一样在叶腋内产生孢子囊而不产生侧芽，而是可形成多个侧芽，待侧芽剥离后，蛇足石杉侧芽则可极易形成不定根，这为蛇足石杉的组织培养提供了一条新思路。马英姿等[47]的蛇足石杉组培试验表明，0.5 mg/L孔雀石绿+100 mg/L AAS的联合可取得较好的灭菌效果，指出外植体可与内生菌共存，也获得了蛇足石杉侧芽，侧芽从主茎分离后转移到生根培养基上，生根率较顶芽显著提高，可达90%，但诱导的新根也呈二叉分枝状。吉枝单等[48]以庐山野生蛇足石杉成年株新生枝茎为外植体，运用植物离体培养技术获得了产生石杉碱甲的叶状体，建立的叶状体具有累积与原植物相同的有效成分石杉碱甲的能力。李晓君等[49]研究了不同浓度蔗糖及植物激素对蛇足石杉茎尖诱导丛生芽和 GGB(绿色小体)的影响，结果表明，添加2%蔗糖和4% 蔗糖的MS培养基有利于蛇足石杉茎尖诱导丛生芽和 GGB，且添加2% 蔗糖的MS培养基也有利于 GGB 可分化出丛生芽，添加10μmol/L IBA的改良MS培养基可促进蛇足石杉丛生芽再生健壮根系从而促进再生植株的移栽成活率。

10 基因克隆、原核表达及其功能分析

杜次等[50]对老年痴呆药——石杉碱甲生物合成的第一个酶赖氨酸脱羧酶进行基因克隆、原核表达及其功能分析，通过TLC检测发现重组融合蛋白 Trx～LDC1 和 Trx～LDC2 均能催化赖氨酸脱羧生成尸胺。罗红梅等[51]对蛇足石杉1～脱氧～D～木酮糖～5～ 磷酸还原异构酶(HsDXR1)基因进行克隆与表达分析，并对HsDXR1 基因在蛇足石杉茎中的表达量进行实时荧光定量 PCR检测，发现该基因优先在茎中表达，其次是根，在叶中HsDXR1 基因表达量最低。但殷秀梅等[52]对蛇足石杉鲨烯合酶HsSQS1 基因进行克隆和序列分析，结果发现，HsSQS1 基因在蛇足石杉根中的表达丰度显著高于茎和叶。这说明，蛇足石杉不同基因在不同部位的表达量也不一样。

11 展望

在生理生化指标方面，仅仅研究了高温胁迫和不同光照对蛇足石杉生理特性和光合特性的影响。蛇足石杉属于高山药用蕨类植物，今后应加强低害和冻害以及不同光质(如红光、蓝光等可调制光)对蛇足石杉生理特性和光合特性的影响方面的研究，为蛇足石杉仿野生种植提供理论依据；在化学成分分析方面，大多研究报道了不同方法、不同产地和不同植株部分对石杉碱甲提取的影响。但方法还有待于改进，取材产地还需进一步扩大。另外，还需要比较一下大棚种植和野外种植蛇足石杉石杉碱甲含量的差异；在内生真菌分离和鉴定方面，大多数研究分离和鉴定出了产石杉碱甲的内生真菌，但并未对这些真菌的转录组、代谢组以及蛋白质组进行组学分析。在提取工艺方面，已经建立了提取石杉碱甲的最佳工艺，但未对蛇足石杉其他药用成分的提取工艺作进一步的研究和探讨；在药理作用方面，主要研究了石杉碱甲等成分的抗ACh E作用，但在脑缺血再灌注中的应用等方面的研究少见报道；在新品种选育方面，筛选的蛇足石杉新品种不多，还需对蛇足石杉种质库进行比较和成分分析，筛选出多个抗逆性强、繁殖速度快、含石杉碱甲高的新品种，以造福人类，满足人类需求；在遗传多样性方面，目前的研究仅限于差异蛋白质点和AFLP分子标记分析，取材范围也较为狭窄，今后将扩大取材范围，建立蛇足石杉种质资源库，并在此基础上采取更多的DNA分子标记方法对蛇足石杉遗传多样性进行分析；在种群结构和地理分布方面，部分学者研究了江西、贵州、广西、重庆、湖南及海南等地的蛇足石杉种群结构、变化趋势及生长速率等，但对浙江、福建、江苏、河南、四川、云南和安徽等地的蛇足石杉种群结构尚无相关研究，今后将对这些省份的蛇足石杉种群结构开展研究，以采取措施来有效保护我国蛇足石杉种群；在组织培养方面，虽然相关报道较多，但重复性不好，且快繁体系尚未完全建立和优化，今后，将进一步筛选出快繁培养基，并探讨一套有效实用的移栽驯化体系；在基因克隆、原核表达及其功能分析方面，目前只对赖氨酸脱羧酶、1～脱氧～D～木酮糖～5～ 磷酸还原异构酶(Hs DXR1)以及蛇足石杉鲨烯合酶 Hs SQS1 基因进行了基因克隆、原核表达及其功能分析，但在蛇足石杉体内涉及到石杉碱甲生物合成的酶较多，还需对更多的酶进行基因克隆、原核表达及其功能分析，旨在为蛇足石杉细胞培养提取石杉碱甲提供分子依据。

总之，药用蕨类植物蛇足石杉在化学成分分析、内生真菌分离和鉴定、提取工艺、药理作用、遗传多样性、种群结构和地理分布多有研究，但在生理生化指标、组织培养以及基因克隆、原核表达及其功能分析等方面少见报道，今后将建立和完善蛇足石杉的快繁体系，加强对蛇足石杉种质资源离体保存的研究，并在此基础上检测其生理生化指标和进行转录组学、代谢组学和蛋白质组学分析，可为蛇足石杉的药理疗效提供分子模式和作用机理。蛇足石杉的生物碱石杉碱甲具有低毒、高效、可逆和高选择性等优点，是乙酰胆碱酯酶抑制剂最佳选择，且对于治疗重症肌无力、中老年痴呆及提高记忆力具有良好的疗效[53]，并对抑制有机磷酸中毒有一定的作用[54]。正因为蛇足石杉的用途广泛、药效显著，是治疗阿尔茨海默病症的特效药，随着世界人口老龄化的加速，蛇足石杉的市场需求量也不断增加，为了获取高额回报，药农无节制地采挖，长期掠夺式的采挖导致野生蛇足石杉锐减，加上在自然状态下蛇足石杉生长缓慢，其孢子需要15年才能萌发，致使蛇足石杉资源快速减少。再加上人工栽培蛇足石杉难度大，而化学合成石杉碱甲成本较高，导致目前石杉碱甲市场销售价格极其昂贵。因此，加强对蛇足石杉种质资源的深入研究，繁育出能满足石杉碱甲类药物生产所需求的原材料，是社会的迫切需求，既可解决药用蕨类植物蛇足石杉原料缺失瓶颈，也可在一定程度上有望解决中药材来源匮乏和缓解野生资源遭受严重破坏的压力，继而可有效地保护好蛇足石杉这种珍贵有限的药用植物野生资源，这对发展我国中医药事业具有重要意义。