小鼠脾生后发育的形态学❋

魏 仑 陈亚敏 张晓芳 郝建红 辛 晓 吴靖芳 高福禄

(河北北方学院基础医学院, 1 2014级临床医学专业本科生, 2 2014级临床医学专业形态学实验教学中心， 张家口 075000;3 河北师范大学， 石家庄 050024)

哺乳动物原始造血系统始于胚外中胚层的卵黄囊。但近年的研究表明，永久造血首先起源于胚内主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros，AGM)区，从AGM区到胎肝迁移路径可能是生成造血细胞的主要部位[1]。之后胎肝、脾、胸腺、淋巴结和骨髓开始造血，且生后造血器官的迁变仍在继续进行。在小鼠胚胎发育期间，造血系统的发生表现为多时间点的连续过程[2]。小鼠脾造血始于胚胎(embryonic period，E)15.5 d，由造血干细胞从卵黄囊血岛或肝经血液循环迁入脾的间充质内，并逐渐增殖分化形成红细胞系、粒细胞系和巨核细胞血小板系，构成髓样造血结构[3]。本研究对小鼠脾生后发育进行了连续的形态学观察，旨在探索脾生后发育规律。

1 材料和方法

1.1 实验动物与试剂

随机选取体重25～35 g的性成熟健康KM小鼠36只，12只雄性，24只雌性(河北北方学院实验动物中心)。生理盐水、Bouin固定液、蒸馏水、石蜡、梯度乙醇、二甲苯、苏木精、伊红、Giemsa染液、过碘酸、Schiff试剂、枸橼酸缓冲液、兔CD36一抗、免疫组织化学ABC试剂盒。

1.2 取材

健康小鼠，雌雄比例按2∶1于晚18∶00合笼饲养，次日早7∶00检查雌性小鼠阴栓，见阴栓之日起为妊娠(gestationday，GD)0 d。所有小鼠均饲养于自然光照充足的环境，自由进食。于 GD19 d 密切观察孕鼠生产情况，生后仔鼠记为生后(puerperal，P)1 d。选择P1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31 d小鼠为研究对象，采用颈椎脱臼处死法，开腹迅速取出小鼠脾，Bouin固定液固定24 h，常规石蜡包埋。切片厚5 μm，裱贴于涂有APES的载玻片。

1.3 H-E染色

石蜡切片常规脱蜡至水，苏木精染核5 min，盐酸酒精分化，自来水返蓝，0.5%伊红水溶液染胞质，脱水、透明，中性树胶封片。

1.4 Giemsa染色

Giemsa染料100 g、甘油66 ml、甲醇66 ml配成储备液。用前以PBS稀释10倍。石蜡切片常规下脱蜡至水，将染液滴于玻片并完全覆盖组织，室温染色15～30 min，自来水冲洗，低浓度乙醇洗涤，镜检，常规脱水、透明、封片。

1.5 PAS染色

石蜡切片常规脱蜡至水，以蒸馏水清洗，将过碘酸滴于玻片使之完全覆盖组织，室温氧化10～15 min。以自来水冲洗5 min，Schiff试剂10～15 min，流水冲洗5 min。苏木精复染胞核，脱水、透明封片。

1.6 免疫组织化学显色

石蜡切片常规脱蜡至水，pH 6.0的枸盐酸缓冲液修复抗原，3%的H2O2溶液封闭20 min以消除内源性过氧化物酶。滴加兔一抗CD36(1∶80)，4℃过夜，滴加羊抗兔lgG二抗37℃孵育30 min，滴加链霉卵白素-过氧化物酶37℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染胞核，脱水，中性树胶封片。阴性对照以PBS代替一抗，其余步骤不变。

1.7 巨核细胞及造血细胞计数

各级样本均为随机选取。各天数小鼠6只，1～7 d内取整脾(此时脾脏体积较小)、9～31 d内取中段脾做石蜡包埋，每个蜡块每种染色依次每隔15张切片取1张，共10张，每张切片随机选取10个完整视野，计数每个视野中巨核细胞及造血细胞的数量。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 小鼠脾生后的组织学特点

H-E染色显示：P1 d小鼠脾红髓较多，为散在的造血灶，可见大量红细胞。白髓于P5 d开始出现，但结构不典型，可见脾小结的结构正在形成(图1A、B，见封三)。红白髓分界在P15 d左右时开始清晰，位于红白髓交界处的边缘区及边缘窦也逐渐形成(图2，见封三)。P31 d接近成年脾结构。近被膜、血管及髓索处可见巨核细胞，且多聚集分布。巨核细胞体积巨大，核大而不规则，常呈折叠或扭曲状、分叶状。染色质粗糙密集成块、无核仁(图3A，见封三)。巨核细胞及被膜小梁呈PAS阳性，巨核细胞呈聚集分布，且多靠近脾被膜、血管及髓索处(图3B，见封三)。巨核细胞数量随脾成熟不断增加，直至成年趋于平稳，PAS染色优于H-E染色，2种染色总巨核细胞变化趋势相同(图4，见封三)。

H-E染色观察到红髓中有类似小淋巴细胞的造血细胞，核大而圆，染色致密呈深蓝色，胞质少而稀疏呈嗜碱性，随脾成熟造血细胞不断增加直至成年趋于平稳(图4，见封三)。Giemsa可清晰区分造血细胞，但对其他组织细胞着色能力较弱，呈淡蓝色或无色(图5，见封三)。

图版说明(图见封底)

2.2 巨核细胞分型

图7 脾CD36免疫组织化学显色显示三型巨核细胞变化趋势Fig 7 Changes of three types of megakaryocyte observed in mouse spleen by IHC

3 讨论

哺乳动物脾可依据有无血窦分2种类型，小鼠属无血窦型脾，以储血功能为主[4]。本研究结果显示，P1 d 脾红髓较多，为散在的造血灶。白髓于P5 d开始出现，但结构不典型，可见脾小结的结构正在形成。红白髓分界在P15 d左右时开始清晰。小鼠于P31 d仍存在有一定量的造血细胞，说明小鼠脾在生后仍具有一定的造血功能。丁剑冰等[5]报道小鼠脾始基于E12 d胃背系膜内形成，E13 d形成原始血窦，E16 d偶见巨核细胞并具产血小板能力，E18 d开始增高，直到成年仍有大量的巨核细胞分布于红髓。本研究通过H-E染色可观察巨核细胞，但特异性较差，无法区分各型巨核细胞。PAS染色特异性随脾成熟逐渐升高，在P15 d后仅巨核细胞及被膜小梁显阳性反应呈红色，与丁剑冰等[5]的报道一致。PAS染色观察巨核细胞优于H-E染色，与李阳友等[6]的报道一致，但PAS也无法区分各型巨核细胞。本实验巨核细胞和幼稚血细胞数量自出生至成年平稳增加，可能与丁剑冰等[5]报道的巨核细胞E18 d开始升高有关，也提示生后脾持续造血，在血小板尤为显著。O′Neill 等[7]进一步指出，脾基质对于维持小鼠长期造血起重要作用[7]。本研究结果显示：巨核细胞与造血细胞的变化趋势大致相同，提示巨核细胞与原始造血细胞的成熟相伴随，这与Klimchenko等[8]研究相符。Lefrancais等[9]报道小鼠肺是具有造血潜能的器官，并作为髓外产血小板的主要部位，可见小鼠脾生后仍具有造血功能[9]。小鼠脾在正常生理情况下即发挥终生造血能力，趋化因子CXCL12(SDF-1)在诱导肝、脾的髓外造血中起重要作用[10-11]。

巨核细胞是血小板的前体细胞，是人体唯一具有多倍体特征的正常细胞。巨核细胞的发生经过造血干细胞、巨核系祖细胞、原巨核细胞、幼巨核细胞、颗粒型巨核细胞、产板型巨核细胞以及巨核细胞裸核[10]。CD36是细胞膜表面的一种糖蛋白和血小板反应素受体，参与调节血小板聚集以及血小板与内皮细胞的黏附作用，表达于血小板、巨核细胞胞质[12]。本研究结果显示：巨核细胞胞质及血小板表面均表达CD36，随着细胞的成熟，CD36表达越来越高，并可区分巨核细胞的3个亚型。杨蕾[13]研究显示：随着体外培养的巨核细胞成熟、调亡血小板增加，多倍体巨核细胞的比例下降，提示巨核细胞产血小板的过程也是巨核细胞凋亡的过程。产血小板型是成熟巨核细胞发挥功能的重要阶段，且占整个成熟阶段的大段时程。在接近成年时，3类细胞的数量最终趋于平稳，处于相对平衡稳定的状态。

本实验显示脾P13 d产血小板型的数量明显下降，可能与肝幼稚血小板和巨核细胞P15 d消失有关[14]。而肝于P15 d之后的造血能力极弱，脾造血能力逐渐增强，提示脾发挥造血功能稍晚于肝，与姜晓君等[15]研究结果相符。早期的脾是类似于红骨髓样的造血组织，造血干细胞在此逐渐增殖分化成各类血细胞。对于小鼠来说，脾是其终生的造血器官之一。