银杏酚C17 1与顺铂联用逆转A549／DDP细胞对顺铂的耐药性

董燕，李月英，张心驰，杨小明，厉琳杰，马文斌

（江苏大学1.医学院，2.食品与生物工程学院，江苏 镇江212013）

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌80%～85%［1］。目前，基于铂类药物的联合化疗方案是NSCLC标准的药物治疗方案之一，但其毒副作用大且易产生耐药性，是治疗失败的重要原因［2］。研究表明，中药因其毒副作用小，效价高，在临床肿瘤辅助治疗中发挥重要作用［3］。

核转录因子E2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，Nrf2）是一种抗氧化应激的核转录因子［4］，其激活后自Keap1蛋白解离进入胞核与抗氧化反应元件（ARE）结合，启动下游靶基因多药耐药相关蛋白1（multidrug resistance associated protein 1，Mrp1）等表达，参与细胞耐药性的调控［5－6］。Nrf2-ARE信号通路在癌症中呈高表达，促进癌症的发生发展，是诱发多种癌细胞耐药产生的重要因素［7］。在肺癌和乳腺癌中，下调Nrf2可显著增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［8］。因此，亟待寻找一种抑制Nrf2／Keap1信号通路的新型物质，来辅助治疗化疗耐药的肺癌。

银杏作为中国传统药物，已有上千年的治疗历史［9］。银杏酚C17 1是银杏外种皮提取物烷基酚类化合物中的银杏酚单体之一，具有细胞毒性，但低剂量时细胞毒性较弱［10］。有研究揭示，与银杏酚其他单体比较，银杏酚C17 1抗肿瘤活性最高，可抑制肝癌HepG2细胞增殖、迁移和侵袭［11］。本课题组前期研究结果表明［12］，银杏酚C17 1与顺铂联用可促进肝癌细胞的凋亡，但其能否作为顺铂的辅助药物增强化疗敏感性尚不清楚。因此，本研究将银杏酚C17 1与顺铂联合作用，观察A549／DDP耐药细胞中Nrf2／Keap1信号通路及下游蛋白Mrp1表达的情况，探讨银杏酚C17 1与顺铂联用对A549／DDP耐药细胞的作用机制。

1　材料与方法

1.1　材料

人肺腺癌A549、A549／DDP细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院。纯度98%银杏酚C17 1（江苏大学食品学院）；RPMI 1640（Wisent公司）；胎牛血清（Gibco公司）；顺铂、MTT试剂（Sigma公司）；Transwell小室（Corning公司）；流式细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC／PI（美国BD公司）；二甲基亚砜（Sigma公司）；Mrp1、Keap1、Bcl2、Bax、β-肌动蛋白及组蛋白H3抗体（Cell Signaling Technology公司）；Nrf2蛋白抗体（Abcam公司）；HRP标记的兔二抗、鼠二抗（碧云天生物技术公司）；PVDF膜、ECL-plus发光剂（美国Millipore公司）。

1.2　方法

1.2.1细胞培养 A549、A549／DDP细胞株培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，并置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中孵育；在A549／DDP细胞培养基中加入1 mg／mL顺铂维持 A549／DDP细胞的耐药性。细胞生长密度达90%时用胰酶消化传代；取处于对数生长期的细胞，进行后续实验。

1.2.2MTT法检测细胞活性 收集 A549、A549／DDP细胞用RPMI 1640培养液稀释成1×105／mL，接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育12 h。根据不同的实验目的进行分组，在检测顺铂对细胞活性的影响时，分为对照组（顺铂0 mg／L）和实验组（顺铂 1，2，4，8，16 mg／L），分别作用于A549／DDP细胞24 h；在检测银杏酚与顺铂联用对耐药细胞活性的影响时，分为对照组［顺铂（0 mg／L）＋银杏酚（0 mg／L）］和实验组［不同浓度顺铂（1、2、4、8、16 mg／L）分别与不同浓度银杏酚 C17 1（10、20、40mg／L）］，共同作用于A549／DDP细胞24 h；每孔加入10μLMTT溶液（5mg／mL），避光培养4 h；弃培养液，每孔加入100μL二甲基亚砜，彻底混合。使用酶标仪（美国Bio-Rad公司）在490 nm波长处测量光密度值（D）。每组实验重复3次，设置5个复孔。细胞相对存活率＝（实验组D均值－空白对照组D均值）／（实验对照组D均值－空白对照组D均值）。

1.2.3Transwell实验检测 A549／DDP细胞迁移和侵袭能力

1.2.3.1细胞迁移实验 取对数生长期 A549／DDP细胞，胰酶消化，用无血清RPMI 1640培养基悬浮细胞，调整细胞密度为2×105／mL。用无血清RPMI 1640培养基配置药物，在下室（24孔板底部）加入500μL含10%血清的RPMI 1640培养液，上室加入300μL悬浮细胞以及相应的药物（0 mg／mL顺铂，4 mg／mL顺铂，4 mg／mL顺铂分别与 10、20、40 mg／L银杏酚 C17 1联用），于 37℃、5%CO2培养箱中培养24 h；4%低聚甲醛固定细胞30 min；吉姆萨染液染色20 min；蒸馏水清洗小室，用棉花将上室内的染液轻轻擦干，待晾干后于高倍镜下（×200）观察细胞，随机选取10个视野计数（迁移细胞数）。每组实验重复3次，计算细胞迁移率＝实验组迁移细胞数／对照组迁移细胞数。

1.2.3.2细胞侵袭实验 用4℃预冷的无血清RPMI 1640培养基稀释基质胶至终浓度为1 mg／mL；取60μL加入小室上部，37℃温育4～5 h使其干成胶状；后续步骤同迁移实验。

1.2.4免疫印迹法检测Nrf2／Keap1信号通路相关蛋白的表达 将对数生长期A549／DDP细胞接种于6孔板，每孔约1×106个，每组设置3个复孔。培养过夜后，分别加入含 0 mg／mL，4 mg／mL顺铂，4 mg／mL顺铂分别与10、20、40 mg／L银杏酚 C17 1联用的培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h；加入预热的细胞裂解液（70μL）裂解细胞，提取总蛋白；100℃煮沸5min；超声仪破碎10 s，离心30 s；提取的蛋白储存于－20℃备用。

配置10%或12%聚丙烯酰胺凝胶，70 V电泳2 h；转膜（PVDF膜）2 h；用含 5%牛奶的 TBST（80 g／L NaCl，2 g／L KCl，30 g／L Tris，0.1%Tween-20；pH＝7.4）封闭 1 h；加入一抗 Nrf2、Keap1、Mrp1、Bcl2、Bax抗体（1 1 000）及内参β-肌动蛋白和组蛋白H3抗体（1 1 000）4℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次10 min；除内参 β-肌动蛋白为鼠二抗（1 1 000），其他蛋白均为兔二抗（1 1 000），孵育1 h；TBST洗膜3次，每次15min；ECL发光剂曝光；Lane 1D凝胶分析软件进行灰度扫描，得出灰度值。蛋白相对表达量＝目的蛋白灰度值／β-肌动蛋白灰度值，每组实验重复3次。1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数期生长A549／DDP细胞，均匀接种于24孔板，每孔约3×104个，每组设3个复孔。过夜贴壁后加药（0 mg／mL顺铂，4 mg／mL顺铂，4mg／mL顺铂分别与 10、20、40 mg／L银杏酚 C17 1联用）培养 24 h；用0.25%无EDTA的胰酶消化细胞，蒸馏水洗3次，离心；取100μL过筛后的细胞（3×104个／mL）悬浮于流式管中，于冰上避光条件下依次加入10μL Annexin V-FITC和5μL PI，轻轻混匀；10 min后加入缓冲液400μL，设置一组单染的阳性对照，2 h内利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3　统计学分析

运用SPSS 22.0软件分析数据，每组实验重复3次，实验结果以均数±标准差(±s）表示，多组比较行单因素方差分析，实验组与对照组比较采用Dunnett-t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。采用Origin法计算肺腺癌细胞增殖的半数抑制浓度（50%inhibitory concentration，IC50）。

2　结果

2.1　顺铂对敏感A549细胞和耐药细胞A549／DDP细胞活性的影响

MTT检测结果如图1所示，单独顺铂作用，敏感A549细胞和耐药A549／DDP细胞活性均不同程度地被抑制，但抑制A549／DDP细胞活性明显需要更高浓度的顺铂；经计算得出 A549和 A549／DDP细胞的 IC50所需的顺铂浓度分别为（7.0±0.09）mg／L和（40.0±0.13）mg／L，A549／DDP细胞对顺铂的耐药性是A549细胞的5.8倍，表明A549／DDP是顺铂耐药细胞株。根据MTT的结果，本研究选取4 mg／L顺铂进行后续实验。

图1　不同浓度的顺铂对A549和A549／DDP细胞活性的影响

2.2　银杏酚C17 1对A549／DDP耐药细胞迁移的影响

与对照组比较，顺铂组耐药细胞迁移率没有显著的变化（P＞0.05）；但与对照组及顺铂组相比，10，20，40 mg／L银杏酚C17 1与顺铂联用明显抑制耐药细胞的迁移能力（P＜0.05），且呈银杏酚C17 1剂量依赖性。见图2。结果表明，银杏酚C17 1能增强顺铂对A549／DDP耐药细胞迁移的抑制能力。

2.3　银杏酚C17 1对A549／DDP耐药细胞侵袭的影响

如图3所示，与对照组相比，顺铂组细胞侵袭力稍有降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组及顺铂组比较，银杏酚与顺铂联用时，随着银杏酚C17 1浓度（10，20，40 mg／L）的升高，细胞侵袭数量呈明显下降趋势（P＜0.05）。由此说明，银杏酚C17 1能够增强顺铂对A549／DDP耐药细胞侵袭的抑制能力。

2.4　银杏酚C17 1对A549／DDP细胞耐药的逆转作用

MTT法检测结果如图4所示，与对照组相比，银杏酚 C17 1（10，20，40mg／L）与顺铂1mg／L联用时，细胞存活率没有明显变化（P＞0.05）；同时，银杏酚 C17 1（10，20 mg／L）与顺铂 2 mg／L联合作用时，细胞活性较对照组也没有明显差异（P＞0.05）。其余各实验组细胞活性与对照组相比差异均具有统计学意义（P＜0.05或 P＜0.01）。结果表明，银杏酚C17 1剂量上调增强顺铂的细胞毒性，逆转耐药细胞对顺铂的耐药性。

图2　不同剂量银杏酚C17 1与顺铂联用对A549／DDP耐药细胞迁移的影响（×200）

2.5　银杏酚C17 1对A549／DDP耐药细胞Nrf2／Keap1信号通路的影响

如图5所示，与对照组和顺铂组相比，顺铂与不同浓度银杏酚 C17 1（10，20，40 mg／L）联合应用组总Nrf2与核内Nrf2表达明显降低（P＜0.05或P＜0.01），其结合蛋白 Keap1表达明显增加（P＜0.05或P＜0.01）。

图3　不同剂量银杏酚C17 1与顺铂联用对A549／DDP耐药细胞侵袭的影响（×200）

图4　不同剂量银杏酚C17 1与顺铂联用对A549／DDP耐药细胞活性的影响

图5　不同剂量银杏酚C17 1与顺铂联用对A549／DDP耐药细胞Nrf2／Keap1信号通路相关蛋白表达的影响

同时下游Mrp1蛋白表达也明显降低（P＜0.05）。由此表明，银杏酚 C17 1可能通过抑制Nrf2／Keap1信号通路逆转 A549／DDP细胞的耐药性。

2.6　银杏酚C17 1对A549／DDP耐药细胞凋亡蛋白表达的影响

如图6所示，与对照组及顺铂组相比，随着银杏酚C17 1浓度的增加，促凋亡蛋白Bax的表达逐渐增强（P＜0.05），而抗凋亡蛋白Bcl2表达逐渐被抑制（P＜0.05）。Bcl2／Bax比值呈现明显下降趋势（P＜0.05），故可初步推断银杏酚C17 1与顺铂联用能够促进耐药细胞A549／DDP的凋亡。

图6　不同剂量银杏酚C17 1与顺铂联用对A549／DDP耐药细胞凋亡蛋白的影响

2.7　银杏酚C17 1对A549／DDP耐药细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，对照组自发凋亡率与顺铂组比较无明显差异（P＞0.05），而银杏酚C17 1（10，20，40 mg／L）与顺铂联用后，与对照组及顺铂组相比，早期凋亡率显著升高（P＜0.05），且呈银杏酚浓度依赖性。见图7。由此进一步确定银杏酚C17 1与顺铂联用能促进A549／DDP细胞凋亡。

3　讨论

肺癌的病死率逐年增加，大多数患者的死亡受到不同程度耐药的影响［13］。近来研究发现，基于中药成分的抗癌药物具有良好的安全性、稳定性和效价高等特点，如银杏提取物（Ginkgo biloba）［14］。迁移和侵袭能力是肿瘤恶性的生物学标志［15］。本研究Transwell实验结果显示，银杏酚C17 1与顺铂联用，抑制肺癌耐药细胞的迁移和侵袭能力且呈浓度依赖性；此外，银杏酚C17 1作用后，顺铂对A549／DDP细胞的IC50显著下降，提高了耐药细胞对顺铂的敏感性。上述结果初步确定银杏酚C17 1可增强肺癌耐药细胞对顺铂的敏感性。

图7　不同剂量银杏酚C17 1与顺铂联用对A549／DDP耐药细胞凋亡的影响

多药耐药的产生机制繁杂，其中Mrp1和肺耐药蛋白（Lrp）表达改变是耐药的重要机制之一［16］。Nrf2／Keap1信号通路参与非小细胞肺癌Mrp1的表达调控，当Keap1表达下降或被其他蛋白如P62竞争结合后，致Nrf2入核与ARE元件上的Mrp1基因启动子结合，促进耐药蛋白Mrp1的表达［6］。Keap1为Nrf2的负调控蛋白，在一些肿瘤如肺癌细胞中，Keap1的突变致Nrf2活性增强，并与标准化疗耐药及肺癌患者高死亡率相关［17］。本研究显示，与对照组相比，单独顺铂组肺癌耐药细胞株中总Nrf2没有呈高表达，但核Nrf2高表达，说明细胞内Nrf2的分布发生了变化。胞质Nrf2入核后，促进下游耐药蛋白Mrp1的高表达，进而抑制药物进入细胞发挥细胞毒性作用；Keap1作为Nrf2抑制剂，其低表达不仅减少Nrf2的降解，同时增强Nrf2入核进而激活Nrf2。但银杏酚C17 1与顺铂联合作用后，与顺铂组相比，细胞内Keap1高表达抑制Nrf2入核，进而核内Nrf2减少，抑制下游耐药蛋白Mrp1的表达，减弱其发挥药物外排的作用。由此表明，银杏酚C17 1可能通过抑制Nrf2／Keap1信号通路逆转肿瘤细胞对顺铂的耐药性。

凋亡是耐药性细胞死亡的重要机制之一，与肿瘤细胞凋亡相关的调控基因有Bcl2、Caspase和P53等家族。Bcl2家族成员Bcl2、Bax、单BH3结构域蛋白等组成一个蛋白质—蛋白质相互作用的网络，通过线粒体外膜的渗透来调节细胞凋亡［18］。Bcl2是抗凋亡基因，而Bax是促凋亡基因，Bcl2／Bax比值是细胞凋亡发生的关键，比值升高抑制肿瘤细胞凋亡，反之降低则促进肿瘤细胞凋亡［19］。本研究结果表明，银杏酚C17 1与顺铂联用可促进肺癌耐药细胞的凋亡，流式细胞术结果进一步证实银杏酚C17 1增强肺癌耐药细胞对顺铂的敏感性，并使凋亡增加。

总之，本研究结果表明顺铂与银杏酚C17 1体外同时作用能对A549／DDP耐药细胞的增殖、迁移、侵袭、耐药蛋白及抗凋亡蛋白产生明显的抑制效果，辅助增敏作用显著。

［参考文献］

［1］Zhang Y，Wang X，Han L，et al.Green tea polyphenol EGCG reverse cisplatin resistance of A549／DDP cell line through candidate genes demethylation［J］.Biomed Pharmacother，2015，69：285－290.

［2］Wu T，Wang MC，Jing L，et al.Autophagy facilitates lung adenocarcinoma resistance to cisplatin treatment by activation of AMPK／mTOR signaling pathway［J］.Drug Des Devel Ther，2015，9：6421－6431.

［3］赵瑛.中药抗肿瘤药理作用研究进展［J］.现代中西医结合杂志，2012，21（33）：3752－3753.

［4］Suzuki T，Motohashi H，Yamamoto M.Toward clinical application of the Keap1-Nrf2 pathway［J］.Trends Pharmacol Sci，2013，34（6）：340－346.

［5］Xia C，Bai X，Hou X，etal.Cryptotanshinone reverses cisplatin resistance of human lung carcinoma A549 cells through down-regulating Nrf2 pathway［J］.Cell Physiol Biochem，2015，37（2）：816－824.

［6］Ji L，LiH，Gao P，etal.Nrf2 pathway regulatesmultidrug-resistance-associated protein 1 in small cell lung cancer［J］.PLoSOne，2013，8（5）：e63404.

［7］Taguchi K，Yamamoto M.The KEAP1-NRF2 system in cancer［J］.Front Oncol，2017，7：85.

［8］Hayes JD，McMahon M.NRF2 and KEAP1 mutations：permanent activation of an adaptive response in cancer［J］.Trends Biochem Sci，2009，34（4）：176－188.

［9］Kennedy DO，Wightman EL.Herbal extracts and phytochemicals：plant secondarymetabolites and the enhancement of human brain function［J］.Adv Nutr，2011，2（1）：32－50.

［10］王云飞，杨小明，李月英，等.银杏酚对 SMMC-7721肝癌细胞和荷H22肝癌小鼠的抗癌作用［J］.江苏大学学报（医学版），2013，23（3）：233－237.

［11］Li Y，Liu J，Liu Y，et al.Inhibitory effect of Ginkgol C17 1 on the biological behavior of tumor cells［J］.Oncol Lett，2017，13（3）：1873－1879.

［12］Liu J，Li Y，Yang X，et al.Effects of ginkgol C17 1 on cisplatin induced autophagy and apoptosis in HepG2 cells［J］.Oncol Lett，2018，15（1）：1021－1029.

［13］Troncome M，Cargnelli SM，Villani LA，et al.Targetingmetabolism and AMP-activated kinasewithmetformin to sensitize non-small cell lung cancer（NSCLC）to cytotoxic therapy：translational biology and rationale for current clinical trials［J］.Oncotarget，2017，8（34）：57733－57754.

［14］Mei N，Guo X，Ren Z，et al.Review of Ginkgo bilobainduced toxicity，from experimental studies to human case reports［J］.J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev，2017，35（1）：1－28.

［15］Ramer R，Bublitz K，Freimuth N，et al.Cannabidiol inhibits lung cancer cell invasion and metastasis via intercellular adhesion molecule-1［J］.FASEB J，2012，26（4）：1535－1548.

［16］Swerts K，De Moerloose B，Dhooge C，etal.Prognostic significance of multidrug resistance-related proteins in childhood acute lymphoblastic leukaemia［J］.Eur J Cancer，2006，42（3）：295－309.

［17］Yamadori T，IshiiY，Homma S，etal.Molecularmechanisms for the regulation of Nrf2-mediated cell proliferation in non-small-cell lung cancers［J］.Oncogene，2012，31（45）：4768－4777.

［18］Renault TT，Dejean LM，Manon S.A brewing understanding of the regulation of Bax function by Bcl-xL and Bcl-2［J］.Mech Ageing Dev，2017，161（Pt B）：201－210.

［19］Paul I，Jones JM.Apoptosis block as a barrier to effective therapy in non small cell lung cancer［J］.World J Clin Oncol，2014，5（4）：588－594.