肝素类制品研究概述

赵梅，朱传利，文良柱，梅丽，卢敏，陈刚

（江苏万邦医药科技有限公司，江苏徐州 221004）

肝素是一种高度硫酸化的糖胺聚糖类化合物，由相同的二糖重复单元通过1,4-糖苷键连接构成，具有强力的抗凝作用，广泛存在于哺乳动物的组织中，如肝脏、肺脏、心脏、肾脏、胎盘、肠黏液和血液中[1]。20世纪30年代，肝素开始用于临床，现在已成为预防和治疗静脉血栓栓塞的主要药物，是应用最广泛的抗凝血药物[2]。2015年，全球肝素市场达到125.8亿美元。

1 普通肝素

普通肝素（Unfractionated heparin，UFH）分子量在3～30kDa，平均分子量为14kDa，主要从牛肺、猪肠黏膜等动物组织器官提取获得，石欣[3]采用猪小肠，通过盐解、离子交换、洗涤、洗脱，沉淀，脱水、干燥制备得肝素钠粗品。臧盛等[4]利用酶解法以猪肺为原料提取出肝素钠粗品。肝素与凝血因子的结合位点较多，可干扰凝血过程的多个环节，出血和血小板减少发生率较高。但其在血液保存、心脏手术、肾透析、抗动脉血栓等传统抗凝血临床应用上仍难以替代。

2 低分子量肝素

低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWH）分子量为3～8kDa，平均分子量为6kDa，其与抗凝血酶Ⅲ结合，通过抑制Xa凝血因子的活性而有效抑制血栓形成，对其他凝血因子影响小。研究结果显示,相对于普通肝素,低分子量肝素生物利用度高，副作用小，引起出血和血小板减少的发生率更低，抗血栓作用强，半衰期更长，是治疗急性静脉血栓和急性冠脉综合症（心绞痛、心肌梗塞等）等疾病的首选药物[5]。目前，低分子量肝素制品已在国内市场占据主导地位。低分子量肝素的目前制备方法主要包括化学降解法、酶解法。

2.1 亚硝酸降解法

亚硝酸降解法是化学降解法制备肝素中最常用的一种制备方法，其以肝素钠为起始原料，在一定的pH条件下，加入一定量的亚硝酸钠解聚肝素钠，生成低分子量肝素钠[6]。目前已上市产品中达肝素、那屈肝素、舍托肝素都为亚硝酸降解法制得。亚硝酸降解法制备肝素，反应条件温和，成本低，产率高，但其制得的产品分子量偏高。

2.2 β-消除降解法

β-消除降解法是以肝素钠为原料，经成盐、成酯、解聚和纯化得到肝素钠片段。目前已上市的药品中依诺肝素钠使用β用消除降解法制得。依诺肝素钠于1993年在美国批准上市，用于预防静脉血栓栓塞性疾病。依诺肝素钠注射液2017年销售值15.75亿欧元。销售额居肝素类药物首位，是全球最畅销的抗血栓、抗凝血药物之一。依诺肝素钠是通过源自猪肠黏膜的肝素苄基酯的碱解聚而获得，其平均分子量约为4.5kDa，使用100mg/mL制剂进行药代动力学试验，皮下注射后3～5 h出现最大抗Xa因子和抗Ⅱa因子活性，平均生物利用度在健康受试者中约为100%[7]。

2.3 酶解法

肝素酶是一类作用于肝素或者硫酸乙酰肝素分子的多糖裂解酶，可特异性裂解肝素大分子中的糖苷键，广泛应用于肝素寡糖及低分子量肝素制备和肝素类分子的结构测定。已上市产品中亭扎肝素（商品名Innohep）使用肝素酶裂解制备。亭扎肝素1991年在欧洲上市，2000年在美国批准上市。亭扎肝素的平均分子量5.5～7.5kDa，抗FXa/抗FIIa活性为1.9～2.8。给药后主要从肾脏排泄，平均清除率1.7L/h，消除半衰期3～4h。较长的半衰期减少了每天的用量[8]。

3 超低分子量肝素

超低分子量肝素（Ultra-low molecular weight heparin，ULMWH），分子量为1.5～3kDa，与低分子量肝素相比较，分子量的分布区间更加集中，有更好的抗血栓活性，更低的出血风险，对血小板的影响更小。在多种转移性或局部进展性实体瘤患者中预防性使用超低分子量肝素后，静脉血栓栓塞事件的发生率大幅降低。目前，对超低分子肝素的研究与开发已成为当前肝素的研究热点。邢新会等[9]使用麦芽糖结合蛋白-肝素酶Ⅰ融合蛋白降解肝素得到超低分子量肝素，但其反应条件苛刻，成本过高，杂质过多难以纯化。王秀云等[10]以β王消除降解法为基础，通过降解、纯化获得超低分子量肝素，但其也存在着抗Xa因子效价过低，抗Ⅱa效价过高，样品纯度不够，会有一定几率导致出血的问题。而合成法合成的超低分子量肝素制品性质稳定均一，消除了天然提取可能引入的杂质（如硫酸软骨素）污染。合成法根据方法的不同可分为化学合成法和酶合成法[11]。

3.1 化学合成法

化学合成法是目前成功获得合成超低分子量肝素的方法之一，已上市产品有磺达肝癸纳（商品名ARIXTRA）。与其他低分子量肝素制品相比较，磺达肝癸纳为具有确定结构的单一化合物，分子量为1728Da。它是目前最高效的高选择性Xa因子抑制剂，用于术后患者治疗静脉血栓栓塞，给药后2h达到血浆峰浓度，半衰期为17h，64%～77%经肾脏以原形药物排出。然而，磺达肝癸纳合成步骤繁琐，最初的合成工艺需70步以上的化学反应，合成路线长，产率低，合成难度大，生产成本高，且合成过程易产生化学污染从而限制了其更好的应用[11-12]。

3.2 酶法合成

Rosenberg等首先通过酶法合成硫酸乙酰肝素。目前，酶法合成制备肝素主要有两种途径：（1）以大肠杆菌K5发酵的肝素前体（Heparosan）为底物，经化学和酶法修饰得到生物工程肝素。BKuberan等在体外条件下模拟了高尔基体内硫酸乙酰肝素（heparan sulfate, HS）的合成，建立了酶法合成HS方法，通过大肠杆菌K5菌株制备HS前体，HS前体经NaOH去乙酰化，在三甲基胺三氧化硫共聚物和碳酸钠的作用下发生N硫酸化，之后在C5异构化酶、2-OST1、6-OST1、6-OST2a以及3-OST1的作用下反应得到抗凝血的硫酸乙酰肝素多糖[13]。（2）以二糖为起始底物经糖基转移酶以UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰葡萄糖胺（或UDP-N-三氟乙酰葡萄糖胺）为单糖供体逐个添加单糖得到多糖骨架，并经化学和酶法修饰得到超低分子量肝素[11]。刘健等报道了体外酶法合成超低分子肝素的途径，GlcUA在肝素前体合成酶2（pmHS2）的催化作用下从UDPGlcUA转移到糖链上，N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）或N-三氟乙酰葡萄糖胺（GlcNTFA）在N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的催化作用下从UDP-GlcNAc或UDP-GlcNTFA转移到糖链上，这两个反应交替进行，延伸合成肝素多糖骨架。C5异构化酶和2-OST、6-OST以及3-OST催化下进行硫磺基团修饰，合成肝素化合物[14]。徐永梅等通过酶法合成了与抗凝血酶相互作用并显示出抗Xa活性的八糖，大鼠模型试验显示其比磺达肝癸纳有更快的清除率，有望开发成为短效抗凝血药物[15]。

然而，酶法合成肝素技术仍然面临很多难点，例如，肝素修饰酶硫磺基供体3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸（3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate，PAPS）价格昂贵且易分解，酶法合成产量不高；肝素修饰酶的表达量低，很难大量获得，这些因素限制了酶法合成肝素的规模化生产[11]。

4 结语

我国是全球最大的肝素类产品出口国，出口结构上，肝素粗品占比重最大，低分子量肝素增长较快，当前庞大的应用群体和肝素类药物临床应用的发展使市场需求不断增长。2008年肝素钠致死事件之后，欧美等国不断提高肝素类药品的质量标准和监管要求[16]。而目前药用肝素主要来源于猪小肠提取物，最终产品分子量分布范围广，在生产过程中不但受到小肠来源与质量的制约，产品还存在着易受动物源性病原体，如病毒、朊病毒等污染的风险。合成法合成肝素，避免了动物源肝素生产过程中可能引入的杂质，可以获得性质稳定均一的药物级纯度的肝素替代传统动物源肝素，很有开发前途。