榄香烯通过c-Met信号通路逆转由肝细胞生长因子诱导的吉非替尼耐药作用

陈　琦，李雄英，唐夏焘

(1杭州市第三人民医院药剂科，浙江 杭州 310009； 2浙江省特种设备检验研究院，浙江 杭州310020)

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)经近10年的上市应用，对EGFR突变的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者有较好的临床疗效，但频繁出现的耐药现象限制了其进一步的应用[1-3]。因此，如何克服 EGFR-TKIs 耐药以及寻找能够逆转这种耐药作用的药物是目前研究的重要内容。榄香烯(β-elemene)是提取于莪术根茎具有广泛抗癌作用的有效成分，是我国自行研发的一种抗癌药物，对多种肿瘤细胞具有抑制作用并且已经引入到临床的治疗使用中[4-6]。有文献报道肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)能诱导肺癌细胞对吉非替尼(gefitinib，Gef)产生原发和继发性耐药[7-8]。本研究旨在研究榄香烯对HGF诱导的吉非替尼耐药人肺腺癌PC-9细胞的影响，并探讨其可能机制。

材　料　和　方　法

1　材料

榄香烯、DMSO、SU11274(c-Met抑制剂)和HGF购自Sigma；吉非替尼购自阿斯利康制药有限公司；非小细胞肺癌PC-9细胞购自上海中国科学院细胞库；MTT购于碧云天生物技术有限公司；抗GAPDH、c-Met、p-Met、AKT及p-AKT抗体购自Cell Signaling。

2　主要方法

2.1细胞培养及药物处理PC-9细胞于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中培养，置于37 ℃、5% CO2和饱和湿度的培养箱中。细胞贴壁生长良好，每3 d传代1次。取对数生长期的细胞进行实验。后续实验细胞加药处理顺序及时间如下：HGF处理24 h后,再分别加入SU11274、榄香烯或吉非替尼处理24 h。

2.2MTT法检测细胞活力取对数生长期细胞以5.0×107/L的浓度接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度药物处理。于培养箱中培养后，每孔加入20 μL MTT(2 g/L)，继续孵育4 h后，终止培养。吸去培养液，每孔再加DMSO 150 μL，在酶标仪490 nm波长处测定各孔吸光度(A)值。每个浓度设平行重复6孔，实验重复3次。计算细胞存活率：细胞存活率(%)=A实验组/A对照组×100%。

2.3Transwell小室实验取对数生长期PC-9细胞，消化细胞于无血清培养基，制成8×107/L的细胞悬液，在Transwell小室的上室中加入含有不同浓度药物的细胞悬液200 μL，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培养基，每组设置3个复孔，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。取出Transwell小室，用棉签擦掉基质胶及上室未穿膜的细胞，甲醇固定10 min，0.1%结晶紫染色40 min。100倍镜下随机选取5个视野计数穿膜细胞数目，取平均值。

2.4Western blot法检测蛋白水平各组细胞经RIPA裂解液裂解30 min，冰上进行操作。收集到EP管，BCA蛋白定量法测定蛋白浓度定量，加入缓冲液于95～100 ℃煮沸5 min，即为样本蛋白。每个泳道蛋白样品10 μg，经10% SDS-PAGE后，利用湿法将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉溶液封闭1 h，分别加入对应 I 抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次后，加入对应 II 抗室温摇床孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL发光试剂盒发光、显影、定影后进行分析。

3　统计学处理

所有实验均重复3次，实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示。应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较应用Bonferroni检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1　榄香烯对肺癌PC-9细胞活力的影响

MTT实验结果显示，随着给药剂量的增加，榄香烯对肺癌细胞的生长抑制率呈显著上升趋势，在给药24 h后，榄香烯的半数抑制浓度(half maximal mhibitory concentration，IC50)为169.31 mg/L。结果表明，榄香烯作用肺癌PC-9细胞后，细胞活力被显著抑制，见图1。

Figure 1.The effect of β-elemene on the cell viability in diffe-rent groups after 24 h.Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 mg/L.
图1不同浓度的榄香烯对肺癌PC-9细胞活力的影响

2　c-met抑制剂SU11274对HGF诱导的吉非替尼耐药细胞的影响

首先，我们用MTT法检测不同浓度的SU11274对PC-9细胞生长的抑制作用，结果显示，随着药物浓度的不断增加，其生长抑制率也随之增加。由于1 μmol/L的SU11274对PC-9细胞生长几乎没有抑制作用，故选择1 μmol/L的SU11274进行后续实验。吉非替尼作用于HGF(50 μg/L)诱导的细胞后，其IC50值比吉非替尼单独作用组明显增高，而SU11274联合不同浓度吉非替尼作用于HGF诱导的细胞后，在相同药物浓度下细胞存活率比单独吉非替尼作用组明显降低，其IC50值明显降低(P<0.05)，见图2。

Figure 2.SU11274 increased inhibition of cell activity induced by Gef.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vs0 μmol/L.
图2SU11274增强Gef诱导的细胞生长抑制

3　榄香烯逆转由HGF诱导的吉非替尼耐药

MTT实验结果显示，肺癌PC-9细胞对吉非替尼敏感，随着吉非替尼浓度的增加，其对PC-9细胞生长的抑制作用不断增强，IC50为0.30 μmol/L。加入外源性HGF(50 μg/L)作用24 h对肺癌PC-9细胞的生长具有明显的促进作用，且能诱导PC-9细胞对吉非替尼耐药，其IC50为0.66 μmol/L。由上述榄香烯MTT实验结果可知，低浓度的榄香烯对细胞活力无明显的抑制作用，故选择10 mg/L浓度作为后续实验浓度。10 mg/L榄香烯与吉非替尼联合作用于由HGF诱导吉非替尼耐药的PC-9细胞时，榄香烯可有效地逆转由HGF诱导的吉非替尼耐药，吉非替尼的IC50值为0.31 μmol/L，见图3。

Figure 3.The effects of β-elemene on IC50value of Gef in PC-9 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsGef;##P<0.01vsGef+HGF.
图3榄香烯逆转由HGF诱导的吉非替尼耐药

4　在外源性HGF存在的情况下，榄香烯联合吉非替尼对肺癌PC-9细胞侵袭能力的影响

Transwell小室实验结果显示，与对照组相比，HGF能显著提高肺癌PC-9细胞的侵袭能力(P<0.01)；在外源性HGF存在的情况下，与吉非替尼单独作用组相比，榄香烯联合吉非替尼能明显抑制肺癌PC-9细胞的侵袭能力(P<0.01)，见图4。

5　榄香烯联合吉非替尼对由HGF诱导的吉非替尼耐药PC-9细胞c-Met通路相关蛋白的影响

Western blot法检测结果显示，与对照组相比，HGF可显著上调p-Met及其下游p-AKT的蛋白水平，提示HGF能明显刺激肺癌PC-9细胞中c-Met和AKT蛋白的磷酸化；在外源性HGF存在的情况下，与吉非替尼作用组相比，榄香烯联合吉非替尼能明显抑制由HGF激活的c-Met和AKT磷酸化水平(P<0.01)，各作用组对c-Met和AKT总蛋白表达变化不大，见图5。

讨　　论

近年来我国肺癌死亡率呈明显上升趋势，已跃居肿瘤死因的第1位，其中非小细胞肺癌约占肺癌的80%。由于大多数肺癌患者在诊断时已处晚期，因而失去了很多早期治疗的机会[9]。随着分子靶向药物的面世，尤其是EGFR-TKIs的出现，为晚期NSCLC的治疗开辟了新的治疗途径。吉非替尼是一种口服的可逆性EGFR抑制剂，其可进入细胞内，直接作用于EGFR的胞内区，干扰三磷酸腺苷结合，抑制酪氨酸激酶的磷酸化，从而阻断细胞增殖和血管生成，促进肿瘤细胞调亡[10-11]。吉非替尼在临床应用过程中，对EGFR突变的NSCLC患者有较好的临床疗效[12]，然而频繁出现的耐药现象限制了其进一步的发展[13-14]。

Figure 4.The impact of β-elemene on HGF-induced resistance to Gef in PC-9 cells was determined by Transwell migration assay (×100).Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsGef+HGF group.
图4榄香烯对由HGF诱导的吉非替尼耐药PC-9细胞侵袭能力的影响

Figure 5.The protein levels of p-Met and p-AKT in HGF-induced resistance to Gef in PC-9 cells treated with β-elemene.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsGef+HGF group.
图5榄香烯对由HGF诱导的吉非替尼耐药PC-9细胞中c-Met及其下游通路相关蛋白表达水平的影响

尽管近年来关于肿瘤细胞耐药性的研究很多，但是，由于这些逆转耐药的药物本身具有的毒性而阻碍了其临床广泛应用，所以真正进入临床的药物就更少了。中草药毒副作用较小，是逆转肿瘤多药耐药的重要研究方向。榄香烯是从天然中草药姜科姜黄属植物莪术中提取分离的倍半萜烯类化合物，目前广泛用于多种恶性肿瘤的治疗，且取得了较好的治疗效果[15]，近年研究发现它可逆转肿瘤细胞的耐药[16-17]。

NSCLC患者存在原发性或获得性对EGFR-TKIs耐药，其耐药机理尚未完全明确，EGFR的二次突变与MET基因的扩增被认为是吉非替尼获得性耐药的重要机制。研究报道，在EGFR-TKIs耐药患者中，常可检测到HGF的过表达。HGF与特异性c-Met受体结合而发挥作用，促进多种组织细胞增生分裂、细胞运动和血管生成[18]。c-Met广泛存在于多种正常组织细胞和体内外恶性肿瘤细胞内。异常的HGF/c-Met信号途径与肿瘤的发生和发展密切相关，在NSCLC患者中c-Met阳性表达者比c-Met阴性表达者存活率低，HGF和c-Met共表达者比任何一种阳性表达者或者两种均阴性表达者相比存活率明显降低[19]。然而，目前榄香烯逆转吉非替尼耐药是否通过HGF/c-Met信号通路尚不清楚。

本研究结果显示，外源性HGF(50 μg/L)对肺癌PC-9细胞的生长有明显的促进作用，同时诱导吉非替尼耐药。榄香烯联合不同浓度吉非替尼作用于HGF诱导耐药的PC-9细胞时其存活率比吉非替尼单独作用时明显降低，说明榄香烯能逆转HGF诱导的吉非替尼耐药。同时，HGF能显著提高肺癌PC-9细胞的侵袭能力，而榄香烯能削弱由HGF诱导的肺癌PC-9细胞的侵袭能力。HGF能明显增加肺癌PC-9细胞中p-Met和p-AKT的表达水平；与吉非替尼组相比，榄香烯联合吉非替尼能明显抑制由HGF激活的c-Met和AKT磷酸化。相同的是，使用c-Met抑制剂SU11274联合吉非替尼作用于HGF诱导PC-9细胞时其存活率也比吉非替尼单独作用时明显降低。

综上所述，本实验初步研究表明榄香烯能够逆转由HGF诱导肺癌PC-9细胞的吉非替尼耐药，其机制可能与抑制HGF活化的c-Met及其下游信号通路有关。

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