iPSCs来源的血细胞在血液系统疾病中的应用与发展

谷雷 林静 王永春 刘玮 文文 赖国祥 柳德灵 刘月彬 陈津 杨忠

脐带血（umbilical cord blood，UCB）、成人骨髓（bone marrow，BM）和外周血（peripheral blood，PB）来源的造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）可分化成各种血细胞，但HSCs的先天缺陷可导致某些血液病。众所周知，BM移植在治疗血液系统疾病上发挥着重要作用，这主要依赖于HSCs的再生能力。然而，自体患者或同种异体供者来源的HSCs严重不足，且缺乏有效扩增HSCs的方法，制约了HSCs的临床应用。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的出现，有望解决这些问题。

一、胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）的缺点及iPSCs的诞生

ESCs和iPSCs等多能干细胞均可分化成所有三胚层细胞[1]。ESCs来源于哺乳动物囊胚阶段胚胎的内部细胞群，人ESCs（human ESCs，hESCs）的研究和应用受到两方面的限制。第一，来源于卵母细胞和胚胎的hESCs涉及伦理问题；第二，来自hESCs的细胞移植是同种异体移植，具有不同抗原，免疫排斥不可避免[2]。为解决上述问题，ESCs样的iPSCs应运而生。

体细胞与ESCs杂交后，有能力分化成所有的细胞类型，表明体细胞的多能性可由在ESCs中表达的一些重编程因子引起。2006年，Takahashi等[3]使用 Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc等4个转录因子对小鼠成纤维细胞进行重编程生成了一种干细胞，即iPSCs。次年，Takahashi[4]和Yu等[5]成功将人体细胞重编程产生了人iPSCs（hiPSCs）。hiPSCs在分子和功能上与ESCs非常相似，可分化产生人体中的所有细胞类型。

二、iPSCs的定向分化

若iPSCs能高效分化成HSCs，BM移植和输血治疗将不再受血液来源和免疫排斥的制约，对基础研究和临床应用都大有裨益。诱导HSCs生成的主要方法包括形成拟胚体和与饲养层细胞共培养。然而，拟胚体却很难将iPSCs诱导成特定的造血细胞[6]。iPSCs与OP9细胞共培养，可诱导分化出造血细胞[7-9]。造血细胞来源的iPSCs较易重新分化成造血细胞[10]。然而，目前干细胞定向分化效率仍较低。DNA甲基化在干细胞分化调节中起重要作用[11]，干细胞的多向分化潜能也与DNA甲基化水平有关。在分析RefSeq启动子的DNA甲基化状态后发现，未分化的间充质干细胞甲基化水平普遍较低[12]。Broeske等[13]发现低活性DNA甲基转移酶-1（DNMT1）小鼠的HSCs不能生成粒细胞和淋巴细胞，提示异常的DNA甲基化会影响HSCs和祖细胞的分化潜能。此外，内皮细胞特殊基因的甲基化，如CD31和CD144，可限制人脂肪干细胞分化成内皮细胞[12]。DNA去甲基化是由染色体10和11之间的基因转位而得名的Ten- eleven转位（TET）蛋白介导的[14-15]，且5-甲基胞嘧啶去甲基的关键酶已确定。去甲基化机制的研究将对iPSCs定向分化成HSCs起重要作用。

三、iPSCs在血液病中的应用

目前，iPSCs主要用于3个领域，即建立疾病模型、药物筛选和细胞治疗（图1）。通过建立特定疾病模型，可解决实验材料来源问题，特别是特定疾病相关细胞类型可在体外产生。患者特异性iPSCs可触发药物的个体反应，用于高效筛选相关药物。许多疾病症状可在移植患者特异性iPSCs后得以缓解。hiPSCs可生成功能成熟的红细胞（red blood cells，RBCs），用于输血治疗；iPSCs来源的神经嵴细胞已用于家族性自主神经异常的治疗[16]。

图1 iPSCs在血液系统疾病中的应用

（一） 疾病模型

iPSCs可分化成所有细胞类型，能产生种系传递，其分化细胞可用于疾病研究和治疗。对于许多遗传病，由于缺乏疾病模型，相关研究受阻。X型慢性肉芽肿病[17]、范科尼贫血[18]、镰状细胞病[19]和真性RBCs增多症[10]等疾病可由患者特异性iPSCs建立相关模型。然而，任何iPSCs模型都要基于以下几点：体外表型可代表体内病理生理学，但需考虑克隆变异性。此外，原始细胞的“表观遗传记忆”可被早期iPSCs部分保留[20]。

（二） 药物筛选

建立iPSCs疾病模型可帮助理解发病机制，大规模筛选药物并促进新药开发。iPSCs具有无限复制能力和克隆性，可提供足够细胞用于复杂的分子分析。因从体细胞重编程的iPSCs系中存在致病突变，故iPSCs来源细胞可诱发疾病相关表型。通过对化学库进行筛选，可能会发现有效治疗某些疾病的药物。

（三）输血治疗

RBCs为组织供氧，白细胞防御病原体入侵，血小板控制凝血。RBCs和血小板临床应用最广泛。为恢复免疫功能，增强抗肿瘤的免疫反应，BM抑制患者还需有足够数量的白细胞。其中，临床对RBCs和血小板需求最大。

1.RBCs：临床上，输注RBCs可挽救许多失血或血液病患者。然而，RBCs一直供不应求。目前，输血用RBCs主要依赖无偿献血，导致RBCs供应极不稳定且有感染各种病原体的风险。而诸如缺乏罕见表型的血细胞，MHC不相容等问题也很难解决。因hiPSCs具有无限增殖特征，有望成为可输注RBCs的可靠来源，且可解决罕见血型短缺问题。

hiPSCs的体外扩增潜能比BM、PB或UCB大得多，其衍生的EBs与干细胞因子（SCF）、Fms-样酪氨酸激酶3（Flt3）配体、白细胞介素-3（IL-3）、IL-6、粒细胞集落刺激因子和骨形态发生蛋白-4（BMP-4）共培养可加速造血祖细胞生成[21]，且拟胚体红系克隆数量和频率在血管内皮生长因子作用下也会提高[22]。Lapillonne等[23]在细胞因子和人血浆共存条件下通过形成拟胚体来分化hiPSCs，获得早期RBCs系，然后在造血细胞因子作用下获得成熟RBCs。Dias等[24]通过hiPSCs与OP9基质细胞共培养的方法来生成RBCs，并发现每个iPSCs均可与OP9共培养生成20万个RBCs。Kattman等[25]发现ESCs和iPSCs分化成中胚层的培养条件并不一致，所以即使胚体是ESCs分化为RBCs的最佳培养环境，但并不代表其是iPSCs分化为RBCs的最佳环境。为此，Kobari等[26]提出先在体外微环境中将iPSCs分化为有核的网织RBCs，再在体内环境中诱导其继续分化成成熟RBCs。因体内微环境因素未能在体外完全模拟成功，体内仍有一些对促进RBCs成熟的因素未被发现，体外诱导分化RBCs的方案有待进一步探究。

目前距临床应用hiPSCs分化的RBCs仍长路漫漫。首先，要确定最佳的无血清良好生产规范条件，以生成安全的临床级RBCs。其次，临床对RBCs的需求量巨大。虽然RBCs可大量生成，但生成的RBCs是有核的，主要表达胚胎和胎儿血红蛋白，极少表达成人血红蛋白，且去核效率低下。研究发现SH2B3基因与健康个体血红蛋白水平和RBCs计数增加有关，通过CRISPR-Cas9介导的SH2B3基因编辑可成功提高hESCs分化培养的RBCs产量[27]，但需考虑iPSCs生成RBCs的工业成本。

2.血小板：血小板在止血、血栓形成和伤口修复中起重要作用[28]。输注血小板已成为治疗血小板相关疾病的重要组成部分，因此血小板的需求正在增加。然而，供者来源的血小板满足不了临床需要，且保质期短，还存在输血相关感染风险和对储存室温的要求，细菌可能会繁殖。此外，通过hiPSCs生成血小板优势之一在于可对其进行基因操控，用于存在同种异体免疫的患者以及作为运载凝血因子等药物至血管损伤部位的载体[29]。因此，hiPSCs来源的血小板可成为输血的潜在来源。

hiPSCs可分化成基于OP9和血管内皮生长因子的内皮细胞和外造血细胞组成的iPS细胞囊，这些细胞囊在TPO、IL-6、IL- 11、肝素和SCF的作用下进一步分化形成MKs，产生的血小板可附着并生长在纤维蛋白原、vWF和I型胶原-涂板上，且可聚集，在试管中收缩纤维蛋白凝块，并且能形成一个培养系统，此系统可从hiPSCs生成MKs前体和功能性血小板。c-MYC的激活可导致超倍体MKs生成增加，且MKs从成血管细胞中产生，避免使用血清（动物）饲料层细胞在分化hiPSCs的过程中所面临的问题。经过辐射介导除去多余多能细胞后血小板移植很安全，且不存在畸形风险。因此，在治疗许多血液病如血小板减少症的过程中，hiPSCs分化产生的临床级、功能性可输注血小板将起重要作用。

然而，hiPSCs来源的MKs和血小板产生效率低且生物活性不稳定限制其发展[30]。Nakamura等[30]用hESCs/ hiPSCs来产生永生的巨核细胞祖细胞株（imMKCL），可低温保存并可在试管中扩增，诱导血小板释放。然而，从imMKCL和人-多能干细胞-来源的MKs中血小板的产量只有3 ～ 10个细胞[31]，而正常的内源性MKs可在体内释放2 000 ～ 10 000个血小板[32]。而且从imMKCL中生成的血小板更小，含颗粒更少，与正常捐赠者来源的血小板相比，其基线激活程度增加，对体外激动剂的反应也减少。通过模拟正常MKs的条件和细胞微环境，可以提高imMKCL来源的血小板的数量和质量[33]。为生成更多数量的MKs和血小板，Moreau等[34]使人多能干细胞过表达FLI1，GATA1和TAL1等转录因子，使其更易生成MKs。该方法利用106个iPSCs分化成2×1011个MKs，这些MKs释放出1×1012个血小板。

四、挑战及展望

（一）挑战：iPSCs诱导分化成造血细胞

1.在iPSCs中观察到许多基因组变化，可能对重编程过程不利：在原始成纤维细胞中，可通过PCR检测到至少50﹪的点突变。Gore等[35]发现在22个人类iPS细胞系的外显子组测序中有124个点突变，但在亲代细胞中没有突变。对hiPS细胞系和小鼠iPS细胞系进行全基因组测序，评估重编程过程对基因突变的影响，结果提示重编程本身并不会导致iPSCs的基因变异，而基因组异常来自克隆iPSCs的突变史[36-37]。当不同的体细胞被重编程时，也应该研究染色体异常的原因。因此，解决iPSCs中基因组变化的问题应该是一个重点。

2.iPSCs保留了其亲代细胞的表观遗传记忆[38-41]，而iPSCs的分化潜力将受到表观遗传记忆的影响：研究发现，与非β-细胞来源的iPSCs相比，β-细胞来源的iPSCs有更好的分化成胰岛分泌细胞的能力[38]。iPSCs和ESCs的差异在持续的传代中越来越小，而在iPSCs的后期传代细胞中未观察到亲本细胞系特征[40,42]。即使带有表观遗传的特征，不同来源的iPSCs也可在一定条件下分化成不同的功能细胞类型[43-44]。表观遗传记忆的基本生物学特征还不清楚，对表观遗传记忆及其对细胞分化影响的研究仍应继续。

3.iPSCs分化的细胞移植到体内后，肿瘤发生机率高，而宿主致癌基因的再激活是主要原因：c-MYC是致癌基因中最经典的重编程因子之一，其严重制约了iPSCs的临床应用。因此，其他因子如LIN28已被用于降低肿瘤发生风险。利用含有LIN28的游离基因载体和非转化性的L-MYC而非c-MYC与p53抑制剂联合，可成功获得高产的iPSCs[45]。

4.产生iPSCs的效率很低：为提高生成效率，在培养过程中可加入一些分子，维生素C是其中一种[46]。在诱导分化过程中，还可通过调节miRNAs水平来提高重编程效率[47]。miRNAs可上调 OCT-4、SOX-2、KLF-4和 MYC 等转录因子的表达，促进体细胞重编程生成iPSCs，miRNAs在缺乏外源性转录因子情况下亦可将体细胞重编程生成iPSCs，比如miR-302，其通过上调OCT-4水平促进细胞多能性[48-49]，而miR-29a的下调却可提高鼠成纤维细胞重编程效率，提示miR-29a的缺失会改变体细胞的DNA甲基化谱并可影响细胞重编程相关基因的表达[50]。然而，生成iPSCs的重编程过程会受到某些疾病的影响。此外，目前还不清楚iPSCs在体内的分化过程。

5.iPSCs分化成功能性细胞困难重重：对血液病而言，产生HSCs及其功能前体细胞至关重要。然而，目前在培养皿中研究造血过程非常困难，也无法利用iPSCs来生成HSCs。因此，需进一步研究iPSCs生成功能性造血细胞的过程和iPSCs再分化的分子机制。

（二）展望：体细胞直接诱导分化成造血细胞

目前人成纤维细胞转化成iPSCs的机制尚不完全清楚，细胞介质使这一转化过程更加复杂，因不能建立理想的重组因子表达环境来诱导细胞多能性，故难以形成稳定的多能干细胞状态。在特定条件下，可诱导成纤维细胞向特定谱系分化。成纤维细胞已能转变成神经细胞、心肌细胞和巨噬细胞样细胞等单细胞类型[51-53]。已有研究揭示人成纤维细胞可直接转化成髓系、红系、巨核系造血祖细胞，而不需先将体细胞诱导成干细胞[54]。

虽然iPSCs在治疗血液病的过程中面临许多问题和挑战，但iPSCs的优势不可否认，未来前景可期。随着iPSCs技术的改进和iPSCs在血液疾病中的研究进展，iPSCs来源的血细胞未来有望广泛应用于血液系统疾病。