饮料化学污染物生物传感检测研究进展

张 莉， 王慧婷， 张 文， 张 奇*， 毛 劲， 范志勇， 江 丰， 余婷婷， 张兆威， 李培武

(1.湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北武汉 430000；2.中国农业科学院油料作物研究所，农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，农业农村部生物毒素检测重点实验室，农业农村部油料作物产品质量安全风险评估实验室(武汉)，湖北武汉 430072)

1 前言

饮料是一种供直接饮用，或用水冲调饮用的乙醇含量不超过0.5%的制品[1]，主要有碳酸饮料、茶饮料、咖啡饮料、果蔬饮料、蛋白饮料、矿泉水等。饮料能提供人体所需的水分和营养成分，具有消除疲劳、提神、保健、娱乐等功能。我国的饮料工业起步于1980年，当年全国饮料总产量不足30万吨；2000年全国饮料总产量为1 490万吨；2015年全国饮料总产量已经突破1.7亿吨，是1980年总产量的567倍[2]。然而，近年饮料质量安全事件频发。为了保障饮料质量安全，我国于2015年11月颁布《食品安全国家标准-饮料》(GB 7101-2015)，规定了饮料中化学污染物的最大限量标准：如展青霉素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等3种真菌毒素，阿维菌素等69种农药残留，铅等3种重金属的最大限量标准。由于饮料化学污染物的限量标准日益严格，因此，亟需研究建立饮料中化学污染物的高灵敏检测方法。

饮料化学污染物检测技术主要有依托气相色谱、液相色谱、质谱等大型仪器的确证性检测技术，以及微芯片、试纸条等快速检测技术。依托大型仪器的确证性检测技术主要用于微量或痕量组分的测定，这些技术具有灵敏度高、准确性高等优点。但因其仪器昂贵、操作环境要求高、技术难度大，前处理繁杂等不足，无法满足当前饮料质量安全现场快速筛查的需求[3]。快速检测方法用时短、操作简单，适宜于现场快速检测筛查。其中，生物传感检测技术作为一种先进的快速检测技术，将免疫反应等产生的信号转换为光电信号读出，具有高灵敏度、高准确性、高特异性等优势，适合大批量样品的现场快速检测。目前，生物传感技术已经在生物技术[4]、食品安全[5 - 6]、环境检测[7 - 8]、医学[9 - 10]、农学[11]等领域得到了广泛的应用。1962年，Clark等人研制了酶传感器用于检测葡萄糖，开启了生物传感器发展的时代。随后，Updike和Hicks成功研制出葡萄糖氧化酶电极，引起了各个领域科学家的高度重视和广泛研究[12]。而随着纳米科学、分析科学、生物科学、纳微电子加工技术的迅速发展及融合，生物传感检测技术已经成为近年来饮料质量安全快速检测筛查的新技术平台。

2 生物传感器的原理与分类

生物传感检测器主要由感受器和信号转换器两部分组成。感受器的主要部分是生物识别元件，包括抗原、抗体、适配体、酶、分子印迹等。识别元件与被测物质特异性反应引起光学、电化学、电学、热学、力学或磁学等信号改变，其信号变化强度与待测物质的含量具有直接或间接的相关性。信号转换器主要由信号转化元件构成，包括光学元件(表面等离子共振等)、电化学电极、压电装置(石英微晶天平等)等[13]。信号转换器可以将光、电化学、电、热、力或磁信号的变化转换成电信号。通过校正和计算，光、电化学、电、热、力或磁信号的变化可以转化为电信号的改变量，从而测定待测物的含量或浓度。

生物传感器的种类很多，根据感受器中生物识别元件所含的生物分子分类可分为：DNA传感器、酶传感器、免疫传感器、细胞传感器、组织传感器、微生物传感器等。根据信号转换器的不同又可以分为：电化学生物传感器、荧光生物传感器、热生物传感器、磁生物传感器、压电生物传感器等[14]。与传统的分析检测手段相比，生物传感器结合了生物、化学、物理等各学科中的最新研究成果，具有以下优点：(1)选择性高，抗干扰能力强，通常不需要进行复杂的样品前处理；(2)体积小，有利于在线监测；(3)可以进行实时原位检测；(4)灵敏度高、分析速度快、样品用量少，可以重复多次使用；(5)分析成本远远低于其它大型仪器分析，适于食品安全检测领域推广应用。

3 生物传感检测技术在饮料质量安全检测中的应用

3.1 重金属生物传感检测

重金属易在水环境和土壤中累积，且难以被微生物降解，可通过食物链影响人类健康。饮料中的重金属主要来自饮料生产的原料以及金属罐包装物、加工设备，包括饮料用水、果蔬、茶、牛奶、咖啡豆等。饮料中的重金属主要有Pb2+、Hg2+、Cu2+、Cd2+、Ni2+等。现有重金属检测方法有原子吸收法(AAS)[15 - 16]、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)法[17 - 18]、电感耦合等离子体-发射光谱法(ICP-OES)法[19 - 20]，但这些方法因对检测环境要求高、仪器便携性差，难以满足现场检测的需求。

生物传感检测技术克服了基质干扰的难题，饮料中化学污染物荧光和拉曼生物传感检测可以提高检测灵敏度。荧光嗜铁素是由铜绿假单胞菌在缺铁状态下分泌的铁载体，Kun等将其作为生物识别元件研制出重金属荧光生物传感器，研究并建立了饮料中Cu2+(中性环境)[21]和Fe3+(酸性环境)[22]的高选择性检测技术。相对于目前的检测Cu2+的方法，该传感器更加简单，已成功地应用于饮用水、海水和生物样品中Cu2+的检测，其结果与电感耦合等离子体质谱法的结果一致。

Song等[23]研制了一种便携式超灵敏纳米棒阵列表面增强拉曼光谱(SERS)传感器用于水中痕量Hg2+的检测。固定于SERS基片上的纳米棒可以结合标记有荧光染料的L-半胱氨酸寡核苷酸探针，当待测液中存在Hg2+时，标记有荧光染料的L-半胱氨酸寡核苷酸探针发生聚合，并游离出纳米棒，生物传感器检测到的荧光强度降低，检测线性范围为1 pmol/L～1 μmol/L，检测限为0.16 pmol/L。基于SERS的Hg2+检测技术容易实现便携化，可广泛应用于大批量饮料质量安全的现场筛查。

Wang等[24]发展了一种检测Hg2+的生物传感技术，该技术将巨磁阻(Giant Magnetoresistance，GMR)传感技术和DNA有机结合。超顺磁性的磁性纳米粒子(MNPs)作为磁偶极子被用于交变电场磁化，磁化后MNPs产生的杂散电场强度与被约束在传感器表面的MNPs的数量成正相关，从而间接与Hg2+的含量具有正相关性，因此可以实现Hg2+检测。检测限为10 nmol/L。T-Hg2+-T中间体使GMR生物传感器对Hg2+具有高选择性，因此，GMR生物传感器具有高灵敏和实时信号输出等优点。

Gumpu等[25]研制的基于脲酶的生物传感器；Hong等[26]研制的基于核酸内切酶的生物传感器实现了对Hg2+和Pb2+的高灵敏同步检测。另外，基于DNA开发的传感器进一步提高了汞、铬、铅等重金属检测的特异性[27 - 29]。

3.2 农药残留生物传感检测

目前，农药已经成为农业生产中必不可少的一部分，严重污染果蔬汁饮料、茶饮料、酒精饮料、咖啡类饮料以及植物蛋白饮料原材料，也会对饮料制造所需的水造成污染。饮料中常见的农药残留包括有机磷类农药残留、有机氯类农药残留、拟除虫菊酯类农药残留等。水果、茶叶中拟除虫菊酯类农药残留问题非常普遍，残留的农药进入加工的饮料中，残留量一般是原果品、茶叶中的30%～50%[30]。传统的农药残留检测的方法主要有气相色谱法[31 - 33]、液相色谱法[34]以及色谱-质谱联用法[35 - 36]。这些方法的检测限低、可靠性强，但仪器昂贵、技术要求高、前处理步骤繁琐。

基于可见光反射光谱，Koukouvinos等[37]发展了饮用水或酒样中多组分农药残留的同步生物传感检测技术，可同时检测毒死蜱、抑霉唑和噻苯咪唑3种农药残留，检测限分别为60、60、80 pg/mL，回收率范围为86%～116%。用5种葡萄酒样进行的比对验证实验结果显示，该传感器检测方法结果与高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)方法结果高度一致。

有机磷类农药和氨基甲酸酯类农药能对人畜体内的乙酰胆碱酯酶产生不可逆的抑制作用，造成神经系统中乙酰胆碱的含量增加，导致人畜患病甚至死亡[38]。研究者利用有机磷类农药和氨基甲酸酯类农药的致病机理研制了基于乙酰胆碱酯酶的生物传感器。Caetano等[39]建立了基于碳糊电极的电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器，与HPLC法相比，该方法的检测限较高，为30.4 μg/kg，但低于巴西对灭多威的限量标准(3 mg/kg)。该方法不需要前处理及后续的清理，省时省力。另外，样品的提取不需要消耗大量的有机溶剂、分析用时短、选择性好，适合大量样品的现场检测。基于可高效吸附乙酰胆碱酯酶的含有壳聚糖、TiO2溶胶-凝胶、还原氧化石墨烯的多层固定基质，Cui等[40]制备了一种高度稳定的可再生电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器，并用于检测白菜汁中的敌敌畏，检测范围为7.9～4 960 μg/kg，检测限为6.4 μg/kg。

Mishra等[41]研发了自流动农药残留电化学生物传感同步检测技术，可以实现牛奶中毒死蜱氧磷、乙基对氧磷、马拉氧磷3种有机磷农药残留的同步检测，测定的时间短，小于15 min。毒死蜱氧磷、乙基对氧磷、马拉氧磷的检测限分别为5.0×10-12mol/L、5.0×10-9mol/L、5.0×10-10mol/L，线性相关系数R2=0.9910。该方法通过检测流经流通池的各有机磷农药的量实现对各有机磷农药残留的检测。在检测过程中可以对样品进行多次取样检测，准确度高，无假阳性和假阴性，检测成本低、灵敏、便携，为牛奶中有机磷农药残留的现场检测提供了可能。

3.3 生物毒素生物传感检测

生物毒素也称为天然毒素，它是一种由植物、动物或微生物等代谢产生的、不可以自我复制的有毒物质[42]。生物毒素主要包括植物毒素、动物毒素、真菌毒素、细菌毒素和海洋毒素等，现已发现的生物毒素有2 000多种[43]。其中，真菌毒素和海洋毒素与食品安全密切相关，这两种毒素污染广、毒性大、难防控，严重污染饮料生产用水以及坚果、花生、玉米等蛋白饮料，果蔬汁、玉米汁饮料等饮料原料。现有生物毒素检测技术主要是基于色谱法[44]、色谱-质谱联用法[45]、酶联免疫吸附法[46]等，不能满足饮料生物毒素现场检测的需求。

黄曲霉毒素(AFT)是由黄曲霉和寄生曲霉代谢产生的一类真菌毒素，天然的黄曲霉毒素根据化学结构的差异分为B1、B2、G1、G2四种[47]。其中，黄曲霉毒素B1(AFT B1)的毒性最强,是已知真菌毒素中毒性最强的一种毒素。动物摄入AFT B1后代谢产生黄曲霉毒素M1(AFT M1)，AFT M1的毒性仅次于AFT B1。Paniel等[48]开发了一种电化学免疫传感器用于检测牛奶中的超痕量AFT M1。该传感器是基于辣根过氧化酶(HRP)作为标记的竞争性免疫分析，检测限为0.01 μg/kg，检测范围为0.01～0.25 μg/kg。与高效液相色谱法、酶联免疫吸附法等传统检测方法相比，该方法前处理简单(仅需样品离心)，操作简单。

微囊藻毒素LR(MC-LR)是毒性最强的海洋毒素，Shi等[49]研究建立了自动化在线光学生物传感系统(Automated Online Optical Biosensing System,AOBS)用于微囊藻毒素LR的快速检测和预警。共价固定在玻璃芯片表面上的囊藻毒素LR卵清蛋白(MC-LR-OVA)与样品中的微囊藻毒素LR竞争结合待检溶液中添加的荧光标记抗体。结果显示，检测范围为0.2～4 μg/L，检测限为0.09 μg/L，回收率为90%～120%。该方法与高效液相色谱法验证结果显示高度一致(R2=0.9762)。Zhang等[50]研制了三维多孔石墨烯传感器用于检测水中的微囊藻毒LR，石墨烯的多孔结构和大的比表面积提高了检测的灵敏度，该生物传感器的检测限为0.05 μg/kg，低于世界卫生组织(WHO)规定的饮用水中微囊藻毒素LR的暂行限制浓度(1 μg/kg)。

赭曲霉毒素A(OTA)是曲霉属和青霉属菌产生的一类真菌毒素，常常污染豆制品、葡萄酒、啤酒、茶等，对人的肾脏、肝脏造成损伤，有较强的致畸形和致癌的作用，还具备免疫毒性[51]。Karczmarczyk等[52]基于耗散型石英晶体微天平(QCM-D)和识别特定分析物的抗体建立了快速、灵敏的检测红葡萄酒中赭曲霉毒素A的生物传感器，并借助与二抗共轭的金纳米粒子(AuNPs)使信号进一步被放大。该生物传感器的线性检测范围为0.2～40 μg/kg，检测限为0.16 μg/kg。Yuan等[53]建立了表面等离子体共振(SRP)生物传感器，用于检测饮料中赭曲霉毒素A。由于OTA-聚乙二醇(PEG)-卵清蛋白(OVA)复合体的形成，提高了其特异性。该表面等离子体共振传感器利用AuNPs增强信号，提高了其灵敏度，检测限低至0.058 ng/mL。检测中样品只需用3%～5%的聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)提取，不需其他处理，前处理简单。

4 结论

饮料质量安全问题已经得到我国政府和消费者的高度重视和广泛关注。生物传感检测技术灵敏度高、准确性高、特异性好，操作简便、稳定性高、耗时短。然而，现有的饮料化学污染物生物传感器多局限于一种或两种化学污染物的检测，生物传感器识别元件的寿命、稳定性和非特异性结合方面依旧存在一定的局限性，不能满足饮料复杂体系的现场、实时、超灵敏自动化检测需求。而随着新型纳米材料的合成、加工和集成技术不断发展完善，微全分析检测系统等将会进一步提高生物传感器的检测灵敏度、通量，缩短检测时间，简化检测步骤，促使研制出集成化、微型化的饮料化学污染物生物传感检测技术，为饮料多种化学污染物混合污染检测提供技术支撑。