小分子化合物诱导细胞重编程研究进展

顾珊 赵高平 李喜和，

（1. 内蒙古大学蒙古高原动物遗传资源研究中心，呼和浩特 010021；2. 内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院有限公司，呼和浩特 011517）

细胞重编程指细胞内的基因表达由一种类型转变为另一种类型，通常包含两层含义：一是分化的细胞重新恢复到多能性或全能性状态；二是从一种分化的细胞转变为另一种分化的细胞。细胞重编程可为临床患者特异性细胞治疗提供无限的细胞资源，研究人员可以通过细胞核移植、转染特定转录因子、小分子化合物诱导等途径进行细胞重编程。细胞核移植技术可以将供体细胞核重新编程，进入类似受精卵发育的过程，发育到囊胚甚至产生完整个体，因此，细胞核移植技术成为早期研究中获得用于疾病治疗干细胞的可能途径，但因细胞核移植技术通常需要使用卵子，而存在伦理问题的争议导致其研究进一步受阻。自2006年山中伸弥等［1］首次利用转录因子介导的方法从体细胞获得诱导多能干 细 胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs） 以来，重编程技术被广泛研究，并试图用于再生医学领域。在重编程技术的引领下，细胞转分化研究兴起。但早前研究的细胞重编程和转分化均涉及逆转录因子的介导，从而增加了基因突变的风险。近些年，研究者们开始探索更安全的细胞类型转换方式，但转换效率极低［2-5］。另外，更多的研究者试图使用小分子化合物诱导细胞类型转换。小分子化合物具有可替代重编程因子的重编程作用。如在诱导神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）到iPSCs过程中，组蛋白甲基转移酶G9a抑制剂BIX01294可替代 Oct4（O）［6］，Kenpaullone可以替代 Klf4（K）［7］。另外，在iPSCs产生过程中，转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）抑制剂 616452可以替代Sox2（S）［8-10］。因小分子化合物具有易渗透到细胞中，非免疫原性，成本效益低，更容易控制浓度和作用时间等诸多优势，其诱导细胞重编程技术成为近年来细胞重编程领域新的研究方向。文中对小分子化合物诱导的几种不同细胞重编程类型做了综述，旨在为今后这方面的研究提供借鉴。

1 小分子化合物诱导多能干细胞

近些年研究发现小分子化合物可以提高重编程效率［11-15］，一些小分子化合物甚至可以替代逆转录因子。研究者试图进一步用小分子化合物替换外源转录因子，最终实现完全的化学重编程。Li等［16］使用Oct4/Sox2/Klf4三个慢病毒表达载体转染Oct4启动子驱动绿色荧光蛋白（Oct4 promoterdriven green fluorescent protein，OG）标记的鼠成纤维细胞（Mouse embryonicfibroblasts，MEFs），同时采用小分子化合物丙戊酸（Valproic acid，VPA）与CHIR99021（CHIR）处理细胞，发现重编程效率显著提高。随后使用Oct4和Klf4转染OG-MEFs，同时在VPA和CHIR基础上，添加TGF-β抑制剂616452组成VC6共同处理细胞发现，15 d 后获得GFP阳性的iPSCs，而仅使用单基因Oct4转染与VC6组合进行重编程的效率极低。进一步研究发现组蛋白H3第4位赖氨酸去甲基化酶抑制剂反苯环丙胺（Tranylcypromine）可显著提高重编程效率，与VC6组合（VC6T）处理仅转染Oct4的OG-MEFs，18 d 后获得GFP阳性iPSCs，该效率相比Oct4与VC6组合显著提高。单基因Oct4与VC6T组合获得的iPSCs（Oct4-iPSCs）具有正常的核型和碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）活性，形态学上类似典型的iPSCs，将Oct4-iPSCs注入免疫缺陷小鼠皮下组织，4周后可形成具有三胚层的畸胎瘤，将Oct4-iPSCs注入8细胞囊胚并移植于代孕母鼠子宫中可生产嵌合鼠。这些结果表明，Oct4-iPSCs具有类似于胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）的特性。

研究发现福斯科林（Forskolin，FSK），2-甲基-5-羟基色胺和D4476等小分子化合物在没有Oct4基因表达的情况下，结合Sox2、Klf4和c-Myc（M）3个逆转录因子，可使OG-MEFs重编程为iPSCs，因此可作为Oct4的化学“替代物”。随后使用VC6T与3种Oct4化学替代物共同处理OG-MEFs，发现VC6T与FSK组合（VC6TF）处理细胞16 d后得到GFP阳性克隆，这些GFP阳性克隆表达E-钙黏蛋白，间质向上皮细胞转化标记，类似于逆转录因子介导的早期重编程。但这些GFP阳性克隆Oct4和Nanog的启动子区维持超甲基化状态，表明Oct4和Nanog在表观遗传上仍处于抑制状态［17］。为了实现完全化学重编程，Hou等［17］进一步筛选其他小分子化合物时发现，VC6TF处理细胞16 d 后加入DZNep（VC6TFZ），可获得更多GFP阳性克隆，这些阳性克隆形态紧凑，具有上皮样特征，无明显边界，大多数多能性标记基因的表达水平升高但仍低于ESCs表达水平，表明GFP阳性克隆仍处于不完全重编程状态。将这些GFP阳性克隆经VC6TFZ处理28 d后转到糖原合酶激酶-3（Glycogen synthase kinase，GSK3）和丝裂原活化蛋白双重抑制（Dual inhibition，2i）培养基后，GFP阳性克隆逐渐转变为ESCs样形态。这些ESCs样克隆可扩增培养30多代并维持ESCs样形态。最后研究者将这些适应 2i 培养体系，ESCs样，GFP阳性克隆定义为化学诱导多能干细胞（Chemically induced pluripotent stem cells，CiPSCs）。 随 后 筛 选其他小分子化合物发现，合成物视黄酸受体配体TTNPB可提高化学重编程效率达到40 倍，达到逆转录因子介导的重编程效率（0.2%）。进一步分析建系的CiPSC发现，其倍增时间（14.1 h-15.1 h）类似于ESCs（14.7 h），具有AP活性并表达多能性标记，其基因表达谱与ESCs和OSKM-iPSCs相似。CiPSCs中的Oct4和Nanog启动子的DNA甲基化状态和组蛋白修饰类似于ESCs。此外，CiPSCs在13代以内具有正常核型和基因组完整性。将CiPSCs注射到免疫缺陷老鼠皮下能形成分化出三胚层的畸胎瘤。将CiPSCs注射到8细胞胚胎或囊胚中能产生嵌合鼠。相比OSKM-iPSCs产生的嵌合体，由CiPSCs产生的嵌合小鼠更健康，存活长达6个月。这些结果表明CiPSCs是完全重编程为多能性干细胞（Pluripotent stem cells，PSCs）。最后经优化后发现4个基本的小分子化合物（C6FZ）任何一个缺失均会显著降低GFP阳性克隆率甚至无法获得CiPSCs。

2 小分子化合物诱导潜能扩展的多能干细胞

PSCs可衍生出两种功能不同的多能性状态，原始态（naive）和始发态（primed）［18］。相比始发态PSCs，原始态PSCs具有更高的发育潜力［19-20］。始发态PSCs具有发育成三胚层的能力，但其不能发育到胚外层组织，如滋养层系，而滋养层系有助于胚盘发育［21］。受精卵和卵裂球在着床前发育均具有全能性，它们可分化产生胚胎和胚胎外谱系［22］。Yang等［23］根据鼠基态多能性条件（PD 0325901，CHIR和人白血病抑制因子（Human leukemia inhibitor factor，hLIF），筛选出一些小分子化合物以支持原始态。首先筛选出一些小分子化合物来激活Oct4远端 增 强 子（Oct4 distal enhancer，Oct4-DE），Oct4-DE在胚胎着床前驱动Oct4基因表达，作为始发态多能性的分子标记。另外筛选出小分子化合物抑制TGF-β信号通路，该信号通路对于始发态hPSCs的自我更新必不可少。最终发现两种小分子化合物，吡啶茚胺马来酸盐（（S）-（+）-dimethindene maleate，DiM） 和 盐 酸 米 诺 环 素（Minocycline Hydrochloride，MiH）支持圆顶状hPSCs长期自我更新。经过优化筛选，研究者建立了由hLIF、CHIR、DiM和MiH（LCDM）4个小分子化合物组成的最优培养体系，该体系可以使始发态hPSCs转化为具有原始态特性的圆顶状hPSCs。LCDM培养体系还可以使hESCs和hiPSCs获得原始态特性。LCDM-hPSCs的生长速度快于始发态hPSCs，并呈现出更高的单细胞克隆效率，表达多能性标记基因，具备分化出三胚层的能力，具有较高的OCT4-DE活性，雌性细胞系中缺乏组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化位点，表明LCDM-hPSCs具备部分原始态hPSCs的特征。使用LCDM-mESCs做嵌合体分析发现，来源于LCDM-mESCs的细胞除了可以整合进入Em组织之外，还能整合进入ExEm组织中，这表明LCDM-mESCs可能具有扩展的发育能力。

3 小分子化合物诱导细胞转分化

鉴于经典的iPSCs诱导技术，研究者相继利用谱系特异性转录因子将体细胞直接重编程为其他类型细胞，如神经元细胞、肝脏细胞和心肌细胞等［24-28］。紧接着，小分子化合物诱导体细胞转分化为不同细胞类型开始被探索。Cao等［29］用a肌球蛋白重链启动子驱动GFP（Alphamyosin heavy chain promoter-driven GFP，aMHC-GFP）标记人包皮成纤维细胞（Human foreskinfibroblast，HFF），使用一些诱导和促进细胞重编程为其他类型细胞的小分子化合物结合心脏发生相关小分子化合物，诱导心脏发生。首先筛选出89个促进重编程的小分子化合物，随后将每种小分子化合物分别添加到含SB431542，CHIR，tranylcypromine和FSK的基础培养体系中，该基础培养体系在单基因Oct4表达情况下可允许HFF转分化为心肌细胞（Cardiomyocyte cells，CMs），HFF在基础培养体系中培养6 d 后，转入心脏诱导培养基（Cardiac induction medium，CIM）中培养5 d，CIM中含心脏发生小分子化合物激活素A，骨形成蛋白4（Bone morphogeneticprotein 4，BMP4），血管内皮细胞生长因子和CHIR，可以提高心脏基因表达。随后将细胞再转入人CMs条件培养基中进一步成熟。经过测试发现，15个小分子化合物（15C）的组合能诱导得到aMHC-GFP阳性克隆，进一步优化条件发 现，CHIR、A83-01、BIX01294、AS8351、SC1、Y27632和OAC27个小分子化合物（7C）对于有效诱导CMs重编程是必不可少的。另外发现血小板源生长因子途径的两个抑制剂SU16F和JNJ10198409（JNJ），可加速HFF基因的下调，并且提高了CMs重编程效率。将两种抑制剂添加到7C中组成9C，可有效地提高诱导CMs重编程效率。研究者将这种化学诱导的功能性CMs命名为（Chemically induced functional CMs，ciCMs），ciCMs表达心肌细胞标记心肌肌钙蛋白和心钠素，免疫荧光检测发现呈现出有序的心肌小节，细胞内膜电位显示ciCMs应对节律性钙瞬变呈现出同步的动作电位，在心脏发生程序上均较类似于人多能干细胞分化得到的CMs。将ciCMs移植入免疫缺陷鼠心肌梗死的部位，两周后鼠心肌梗死部位发生部分再肌化。这些结果表明ciCMs被高度重编程，且功能类似CMs。

Zhang等［30］使用成纤维细胞特异性蛋白1-Cre/ROSA26tdTomato系统从原代MEFs中排除神经组织细胞，经流式细胞仪分选获得的MEFs称为tdMEFs，作为诱导NSCs的材料。随后筛选出一些小分子化合物诱导MEFs的神经相关基因表达。BMP I型受体ALK2/3的抑制剂LDN193189和TGF-b I型受体ALK4/5/7的抑制剂A83-01，是抑制中胚层和内胚层特化的两种小分子化合物。GSK3抑制剂CHIR和碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblasts growth factor，bFGF）是支持神经发育的两种小分子化合物。这四种小分子化合物组合为化学特定培养基（M4）作为神经诱导的基础条件。Sox2和巢蛋白（Nestin）是NSCs的两个典型标记基因，MEFs经M4培养基培养10 d 后，未检测到Sox2+/Nestin+细胞。而在M4中添加Smo拮抗剂Hh-Ag 1.5和维甲酸组成M6后培养MEFs，10 d 后获得Sox2+/Nestin+细胞。另外，甲基转移酶抑制剂RG108，组蛋白去甲基化酶抑制剂tranylcypromine和自噬调节剂SMER28可进一步促进Sox2+/Nestin+细胞的产生，将这3个小分子化合物添加到M6中组成M9。M9可有效诱导成纤维细胞转分化为Sox2+/Nestin+细胞，去除其中任何一种均影响重编程效率。进一步研究发现M9处理的细胞经过一个MET过程，第6天逐渐出现克隆，这些经过MET过程的克隆具有AP活性，6 d 后，Sox2基因大量表达，到第10天，NSCs相关基因包括Pax6、Sox2、Ascl1和Olig2表达。随后将M9诱导得到的Sox2+/Nestin+细胞转入含bFGF和表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）的常规NSCs培养基中。这些细胞呈现出指数增长模式，悬浮培养后可形成神经球，细胞周期分布类似于原代神经前体细胞（Primaryneural progenitor cells，pri-NPCs）和NSCs。研究者将这种由纤维细胞获得、增殖速率快、呈Sox2+/Nestin+并可自我更新的细胞命名为化学诱导神经干细胞样细胞（Chemical-induced neural stem cell-like cells，ciNSLCs）。ciNSLCs在无 bFGF 和 EGF的分化条件下可分化为Tuj1+神经元和GFAP+（glial fibrillary acidic protein）星形胶质细胞。

4 展望

小分子化合物诱导细胞类型转换已在人和鼠体内实现，通过小分子化合物从体细胞诱导获得更安全的iPSCs、ciCMs和ciNSLCs，这些诱导细胞为临床患者特异性治疗带来了希望。但小分子诱导细胞类型转换效率有得提高，这也是目前小分子化合物研究的热点和难点。此外，细胞重编程的内在机制还需进一步明确，从而筛选出更加安全可靠、诱导效率更高的小分子化合物或其他物质，从而为疾病治疗提供有效的细胞资源。同时，这一研究有望对揭示某些癌症的诱因并针对性提出相应的治疗方案提供理论依据。另外，诱导细胞重编程研究主要集中在人和鼠的物种上，对其他大型哺乳动物如家畜猪牛羊的研究较少，也是未来需要探究的领域。

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