植物NAC转录因子功能研究进展

王春雨 张茜

（1. 西北农林科技大学农学院，杨凌 712100；2. 西北农林科技大学食品科学与工程学院，杨凌 712100）

NAC转录因子是近年来新发现的具有多种生物学功能的植物特异转录因子，广泛分布于陆生被子植物的基因组中，是植物最大的基因家族。1996年，Souer等［1］从矮牵牛中克隆出了第一个NAC基因NAM（No Apical Meristem），随后又在拟南芥中发现了ATAF1/2和CUC2这三个转录因子基因［2］。序列比对分析结果发现，NAM、ATAF1/2和CUC2所编码的蛋白质具有较高的同源性。虽然它们的生物学功能各不相同，但是都具有相似的N端结构，并以其首字母命名为NAC结构域。目前，在许多植物中都发现了众多的含有NAC结构域的NAC家族转录因子。全基因组分析发现，水稻（Oryza sative）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）中分别至少有151和117个NAC家族转录因子基因；杨树（Populus trichocarpa）中至少含有163个成员；而在大豆（Glycine maxL.）和烟草（Nicotiana tabacum）中均有至少152 个成员［3］。在大麦（Hordeum vulgareL.）和柑橘（Citrus limoniaOsbeck）的EST数据库中分别发现了48和45个NAC转录因子［3］。因此，NAC转录因子被认为是至今发现的植物基因组中最大的转录因子家族之一［4］。

1 NAC转录因子结构特征分析

NAC转录因子具有显著的结构特点，即蛋白的N端都有一个高度保守的约150个氨基酸组成的NAC结构域，含有A、B、C、D、E五个亚结构域，其中亚域C可能与结合DNA有关，亚域E可能参与发育时期调控和（或）组织特异性，并协同亚域D与DNA发生相互作用［5］。NAC转录因子C端转录激活功能区具有高度的多样性，该端的共同特点是一些简单氨基酸，重复出现的频率较高，同时富含丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸或酸性氨基酸残基等，这是植物转录激活结构域的典型特征［6-7］。对拟南芥基因组分析发现，在其C-端包含α-螺旋跨膜序列（TMs），至少13个拟南芥NAC蛋白具有跨膜功能，并且很多假定的NAC-MTFs基因在胁迫下上调，表明它们可能参与胁迫响应［5］。尽管如此，Ooka等［8］仍从预测的NAC蛋白的C-端发现了13个共同序列，这些序列分别存在于12个NAC亚组。

2 NAC转录因子基因家族的生物学功能

NAC转录因子家族成员众多，在植物不同发育时期和多种环境因素诱导下，激活特定目的蛋白，发挥着各种重要的生物学功能，主要涉及对植物的生长发育调控、植物的逆境胁迫应答、调控植物的抗病性、参与植物次生生长调控以及激素信号转导等过程。例如，拟南芥NAC转录因子ATAF2被认为在病程相关基因表达过程中起阻遏物的作用［9］，而ATAF1是植物体在对营养真菌和细菌病原体侵染的防御反应中的负调节因子［10］，拟南芥中的转录因子CUC2在调控叶裂的发育中起着重要作用［11］。除此之外，更多的NAC转录因子不断被发掘，本文就有关NAC转录因子功能的最新研究进行综述。

2.1 对植物生长发育的调控

植物基因组基因的有序表达是植物生长发育的基础，NAC转录因子在植物生长发育过程中起着“分子开关”的作用。例如，Evans等［12］通过转基因技术对棉花中的GhNAC20和GhNAC18两个转录因子进行研究。用VIGS技术敲除GhNAC20基因，GhNAC20基因沉默植株的叶片衰老延迟，而过表达GhNAC18转基因拟南芥出现衰老延迟的现象。结果表明，GhNAC20是叶片衰老的正调控因子而GhNAC18起抑制作用。又使用4种激素——脱落酸（ABA）、茉莉酸（MeJA）、水杨酸（SA）及乙烯（ET）处理植株发现，GhNAC20和GhNAC18与植物的应激反应也有关系。闫朝辉等［13］通过农杆菌介导的叶盘法对于“粉红亚都蜜”葡萄VvDRL1转录因子的转基因研究结果显示，转入VvDRL1基因的烟草生长迟缓，株高、叶面积和叶片细胞面积较野生型烟草均明显缩小，且出现叶片向内卷曲的现象，研究结果表明VvDRL1在调控植株的形态发育方面起着重要作用。NAC转录因子除了能调节叶的生长之外，对于根的生长也有调控作用。岳俊燕等［14］对于中间锦鸡儿的CiNAC1转录因子的转基因研究结果显示，拟南芥CiNAC1转录因子基因过表达株系的侧根数目明显高于野生型拟南芥，表明过表达的CiNAC1基因促进了拟南芥侧根的发生，同时发现CiNAC1基因也促进了主根的伸长。研究认为，CiNAC1基因可能与中间锦鸡儿响应逆境胁迫机制有关。Jiang等［15］在荔枝果实的研究中发现了一个NAC转录因子LcNAC1，它在荔枝果皮和果肉的衰老过程中表达量会增加，表明它可能会促进荔枝果实的衰老。在这些研究中可以看出，NAC转录因子对植物根、叶、果实等器官发育的调控、对调节植物的生长发育都有重要意义。

2.2 与植物的环境胁迫应答有关

植物的生存环境复杂多变，经常遭受干旱、高盐、低温和病虫害等逆境胁迫，影响植物的生长发育，甚至会造成植物死亡，严重影响农业生产和生态环境。植物通过基因的表达调控可以抵抗逆境胁迫的侵害。其中NAC转录因子在植物对逆境胁迫的响应过程中的调节具有重要作用。Mao等［16］利用了转基因拟南芥对小麦的TaNAC67转录因子进行了研究，研究表明，过表达TaNAC67基因的转基因拟南芥植株对于干旱、高盐和寒冷胁迫的耐受能力显著增强，但是对于拟南芥植株的正常生长却没有任何不良的影响。这说明，TaNAC67在小麦对于这三种逆境胁迫下的响应具有潜在的功能。余海霞等［17］在对芒果抗逆性的研究中，通过改良5'末端RACE技术获得了芒果转录因子基因MiNAC。利用荧光定量技术对芒果MiNAC基因在4℃低温、300 mmol/L NaCl和30% PEG胁迫处理（模拟干旱）后的表达模式进行检测，研究结果发现，芒果MiNAC基因在这三种胁迫诱导下的表达量均显著增加，表明该基因参与了芒果逆境胁迫的分子调控。陈希瑞等［18］利用农杆菌介导的芽尖转化技术将GmNAC4转录因子基因转入棉花中，获得了转基因棉花植株。再用一定浓度的NaCl处理，发现转入GmNAC4基因的棉花耐盐性显著提高，这说明GmNAC4与棉花对盐胁迫的响应密切相关。韩聚东等［19］利用酵母单杂交技术对梭梭中的HaNAC3转录因子的转录激活功能进行研究发现，HaNAC3是一个定位在细胞核中、具有转录激活功能的转录因子蛋白，进一步的烟草转基因研究结果表明，转入HaNAC3基因的烟草在干旱、高盐和低温条件下的生存能力显著提高，这些结果表明梭梭中的HaNAC3基因具有抗旱、耐盐、耐低温的功能。樊波等［20］利用local blast的办法，从结缕草转录组中比对得到了ZjNAC036基因序列，并通过RT-PCR等方法从日本结缕草中分离出该基因。经NCBI/BLASTx分析推测该基因为NAC类转录因子基因，实时荧光定量RT-PCR结果显示，该基因在干旱情况下的表达量上调，表明ZjNAC036在干旱逆境生理上可能有重要的作用。转录因子不仅仅可以通过转录激活功能调控基因的表达，直接调节植物对胁迫环境的耐受能力，还可以通过在各种生化代谢途径中发挥调节因子的作用从而调控植物的胁迫耐受力。例如，罗莉琼等［21］通过RNAi技术和构建过表达株系对水稻OsNAC2转录因子基因进行研究，结果显示，在干旱和高盐胁迫下的OsNAC2基因表达量下降，且RNAi株系表现更好的干旱和高盐抗性，而过表达OsNAC2降低了水稻对NaCl的耐受性，且在营养生长时期对干旱更为敏感。这些结果表明OsNAC2是一个负调控干旱和高盐胁迫响应的转录因子。接着对野生型和OsNAC2过表达植株进行了基因差异表达分析，在过表达植株中被下调的基因大多在ABA途径中发挥重要作用，因此猜测，OsNAC2可能通过ABA依赖途径来负调控水稻的多种非生物胁迫反应过程。除此之外，何建美等［22］对水稻OsNAC2基因也做了研究，结果表明，OsNAC2可能同时参与IAA与GA的代谢途径，调节根的生长发育，从而影响植物的抗旱性。Fang等［23］在山葡萄中发现的VaNAC26转录因子，通过构建拟南芥异源表达体发现，VaNAC26可以通过上调茉莉酸合成基因和茉莉酸信号通路中的基因表达，提高拟南芥体内的茉莉酸含量来增强其对干旱的耐受力。NAC转录因子基因在逆境胁迫下的表达不仅受到环境的影响，而且也会受到植物进化过程中基因的变化的影响，从而导致其在功能上产生差异。例如，Mao等［24］对玉米NAC转录因子ZmNAC111的研究发现，在玉米ZmNAC111基因中的一个82 bp的寡核苷酸序列的插入会在RdDM（RNA指导的DNA甲基化）途径中，通过使DNA和组蛋白超甲基化抑制ZmNAC111基因的表达，从而导致玉米的抗旱性的降低。NAC转录因子对于干旱、盐渍化、寒冷等环境胁迫的响应往往会引起植物体内生化调节网络产生复杂的变化，其更深一步的调节机制还有待进一步的研究。

2.3 参与植物的抗病性调控

在植物的生长发育过程中，植物经常会受到病毒、真菌和细菌及其它病原物的侵害，从而促使植物形成了一系列复杂的抗病机制。当病原菌在侵染植物时，植物通常通过乙烯（Ethylene，ET）、水杨酸（Salicylic acid，SA）、茉莉酸（Jasmonic acid，JA）等抗病信号的传导途径来激活大量防卫反应基因的协同表达，从而使植物的抗病防卫反应途径得以激活。陈娜等［25］对于茄子SmNAC转录因子的研究表明，SmNAC基因的表达降低了茄子对青枯病的抗性。并且在过表达植株与基因沉默转基因植株的研究中发现，SmNAC过表达茄子植株中的水杨酸含量显著低于非转基因植株，SmNAC基因沉默植株中的水杨酸含量显著高于非转基因的感病植株，由此猜测SmNAC是通过抑制了水杨酸合成基因的表达来降低茄子对于青枯病的抗性。Chen 等［26］在大麦中发现的转录因子HvNAC6 可以增强大麦对白粉病（Blumeria graminis f.sp.hordei）的抗性。并且通过构建HvNAC6基因沉默株系发现，ABA在HvNAC6对于大麦白粉病的抗性增强作用中起正向调控的作用。Dalman等［27］在挪威云杉基因组中发现的两个转录因子基因——PaNAC03和PaNAC04，通过氨基酸序列比对的相似性，可以证明这两个基因属于NAC 家族。通过白腐菌［Heterobasidion annosum（Fr.）Bref. sensu lato］接种实验和机械伤害刺激发现，PaNAC03/04的表达量均显著升高，且在生物胁迫的应答过程中表达量均高于非生物胁迫。表明PaNAC03和PaNAC04很可能增强挪威云杉对于白腐病感染的耐受力。在进一步的PaNAC03过表达实验中发现，PaNAC03过表达株系的胚胎发育不正常，说明PaNAC03不仅在挪威云杉响应外界胁迫中起重要作用，而且对其胚胎发育也有重要的调控作用。此外，还发现PaNAC03可以抑制类黄酮的生物合成。在不同的植物中，NAC转录因子除过能帮助植物抵抗病菌的感染之外，也能作为一个负调控因子调节植物对于病菌感染的耐受力。Wang等［28］在小麦中就发现了这样一个NAC转录因子。小麦中的TaNAC1在其对条锈病的响应途径中起一个负调控因子的作用。当TaNAC1基因沉默时，转基因拟南芥对于条锈病和假单孢杆菌的抗性增强，而当TaNAC1基因过表达时，拟南芥对于这两种病菌的抗性增强。对于其下游基因表达的研究结果显示，TaNAC1很可能是通过影响茉莉酸的合成和抑制水杨酸合成基因的表达来调控其对条锈病的抗性。同时，在此研究中发现，TaNAC1还可以影响侧根的发育，这更说明了NAC转录因子功能的多样性。

2.4 参与植物次生生长调控

植物的次生生长是一项重要的生命活动，特别是次生木质部的形成对人类生产和生活具有重大意义。次生生长包括维管组织形成、次生细胞壁形成、木质化、细胞程序化死亡以及心材形成等过程。近年，研究发现多个NAC基因对植物的次生生长起着调控作用。Xiao等［29］对玉米两个NAC转录因子ZmNST3和ZmNST4的功能进行了深入分析。原位杂交结果表明ZmNST3/4特异的在次生壁积累的细胞中表达。表型回补实验结果显示，ZmNST3/4能促进植物次生壁的发育。过表达ZmNST3/4可引起转基因拟南芥束间维管次生壁加厚，木质素、纤维素含量增加。这表明NAC转录因子在植物的次生生长过程中也有重要的作用。王中娜等［30］利用实时荧光定量PCR技术对亚洲棉30个NAC 转录因子构建表达图谱，鉴定出7个在亚洲棉纤维细胞次生壁加厚期优势表达的基因（GaNAC05、GaNAC75、GaNAC20、GaNAC71、GaNAC40、GaNAC09和GaNAC69），并进一步明确了它们在亚洲棉、雷蒙德氏棉和陆地棉中的表达模式差异。猜测这7个基因在亚洲棉的纤维细胞次生壁加厚中可能有重要作用。Ishii等［31］对于烟草嫩黄二细胞的研究中发现，一个维管结合NAC转录因子蛋白VND7可以调控烟草次生壁中的木聚糖含量，并在此过程中起正向调节的作用，表明其与烟草次生壁的合成有关。李会萍等［32］从慈竹转录组中筛选得到两个基因BeNAC3和BeNAC4，并通过系统进化树分析表明这两个基因属于NAC转录因子基因家族。接着用荧光定量数据检测其在不同组织中的表达发现，相对茎和未展开叶，BeNAC3在笋和展开叶中的表达量相对较高，且在展开叶中的相对表达水平更为显著；BeNAC4的表达具有明显组织特异性，在茎中的表达量最高，约为笋中表达量的25倍，其次是展开叶，而在幼嫩的笋和未展开叶中的表达量较低。表明这两个基因可能参与慈竹的次生生长调控。最新又发现了NAC转录因子在植物的蛋白质和脂类合成过程中可能发挥着重要的作用。Chi等［33］在拟南芥中发现的NAC跨膜蛋白AtNTL7可以参与拟南芥的内质网膜胁迫的调控中，并在其中起正向调控作用。由于内质网在生物体中蛋白质、脂类合成，蛋白质折叠等生化合成途径起关键作用，所以推测NAC转录因子基因AtNTL7在调节蛋白质和脂类的代谢途径中有重要作用。NAC转录因子对于植物次生生长乃至是生化代谢物的生物合成都有重要的作用，其功能还在进一步的研究之中。

2.5 参与植物激素信号转导

植物激素在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发以及离体组织培养等方面调控植物的生长、发育与分化，因此，植物激素对植物的生长发育具有重要的调节控制作用。NAC转录因子可以通过调节ABA、GA等植物激素的合成来对植物的生长发育或是抗逆性进行调控。卢嘉宝等［34］在拟南芥中，通过杂交获得了nac019nac055、nac019nac072和nac055nac072双突变纯合体和三突变体nac019nac055nac072。经ABA处理后，野生型和NAC突变植株的ABA通路关键基因（RD29A、RAB18和RD29B）表达量显著上调。但在NAC三突变体nac019nac055nac072以及NAC双突变nac019nac072、nac019nac055植株中RD29A、RAB18和RD29B的诱导表达与野生型无显著差异，而单突变体nac072和双突变体nac055nac072比野生型显著上升，双突变体nac055nac072的表达变化最显著，推测NAC072和NAC055在ABA响应下游基因调控中可能发挥负调节作用，NAC072的作用更大，而NAC019可能拮抗前两者。Shen等［35］在水稻中克隆得到了转录因子基因OsNAC2，通过构建OsNAC2的过表达株系和基因沉默株系发现，OsNAC2过表达株系对高盐和干旱的抵抗能力降低，且在干旱条件下产量降低。基因沉默株系在营养生长与生殖生长时期对于干旱和高盐胁迫的抵抗能力增强，并且在干旱胁迫后产量明显提高。基因表达图谱分析证明，OsNAC2通过直接与在ABA信号途径和抗逆途径中表达的基因——LEA3和SnRK2蛋白激酶基因OsSAPK1的启动子结合来抑制它们的表达。实验表明，OsNAC2转录因子通过在ABA依赖途径中充当一个ABA和胁迫响应基因的负调控因子来调节水稻对非生物胁迫的响应。Mao等［36］对水稻OsNYC3转录因子的调节机制进行了进一步的研究。首先构建水稻OsNYC3过表达株系和RNAi株系，发现过表达株系叶片的衰老速率显著快于野生型，而RNAi株系叶片衰老速率显著慢于野生型。说明OsNYC3在叶片衰老途径中起着负调控因子的作用。进一步的酵母单杂交和染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR实验证明了OsNYC3通过与叶绿素降解基因OsNYC3和OsSGR的特异结合来促进这两个基因的表达，并且通过上调ABA生物合成基因（OsNCED3和OsZEP1）和ABA降解基因（OsABAox1）的表达来调节水稻植株内的ABA水平。而ABA对于OsNYC3基因的表达又起着反馈抑制的作用。这些结果表明，OsNYC3通过调节水稻体内的叶绿素与ABA的合成来调节叶片的衰老。无独有偶，Oda-Yamamizo等［37］通过研究拟南芥中的转录因子ANAC046发现，它通过与调节叶绿素衰老的基因的启动子结合而激活其表达，从而使叶片中的叶绿素含量降低而加速叶片的衰老。这些结果表明，ANAC046在调节叶绿素降解和叶片衰老过程中起着正向调控因子的作用。Lv等［38］对黄花蒿中的一个NAC转录因子AaNAC1的研究发现，当AaNAC1在黄花蒿（A.annua）中过量表达时，青蒿素合成基因的表达会被明显上调，从而导致黄花蒿体内的青蒿素和二氢青蒿酸含量显著增加，其对于葡萄孢菌感染和干旱胁迫的耐受性也明显增加。利用过表达AaNAC1转基因拟南芥也验证了其对葡萄孢菌感染的耐受性会显著增强。这些研究结果在培育高含量青蒿素和抗旱的黄花蒿中具有实际应用的意义。另有研究表明，NAC转录因子还可以调节植物对营养元素的吸收，从而影响植物的生长。He等［39］在他们的研究中发现，过表达NAC转录因子基因TaNAC2-5A的小麦植株，根部的生长更加旺盛，并且根细胞中硝酸盐的流入更加剧烈，从而增加小麦对氮素的吸收，提高地上部分植株的含氮量和小麦的产量。因此推测TaNAC2-5A转录因子在小麦吸收氮素的途径中发挥积极作用。以上研究可以表明，转录因子通过对植物合成激素甚至是吸收营养元素的途径进行调控，从而调节植物的生长发育或对于生物与非生物胁迫的忍耐力。

3 展望

NAC转录因子是成员最多的植物特异的转录因子之一，迄今为止已经在几十个植物体内发现了NAC转录因子的存在，并且对其在结构、功能、表达特性方面的研究也取得了一定的进展，但NAC转录因子在调节植物发育、参与植物次生生长代谢、参与植物非生物及生物胁迫响应中的分子机制和功能多样性仍然还需进一步的研究和证明。随着基因芯片、蛋白芯片等高新分子生物技术的迅速发展，利用优势基因来培育优良的植物品种已经成为现实。对于NAC基因的研究表明，NAC基因在改良作物品质，提高植物的抗逆性等方面发挥了重要的作用，因此，继续深入研究NAC转录因子的分子机制对于植物品种的改良具有重大意义。