硬粒小麦染色体的FISH核型分析

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(1.贵州大学农学院，　贵阳 550025；　2.国家小麦改良中心贵州分中心，　贵州 贵阳 550025)

硬粒小麦(TriticumDurum，AABB，2 n=28)是世界重要的粮食作物之一,最早在美国和意大利种植较多，后来传播到北非、中东、欧洲等地并逐步扩散到世界各地。如今硬粒小麦播种面积约占世界小麦总面积的十分之一，仅次于普通小麦,居栽培小麦的第二位。硬粒小麦是一种四倍体栽培小麦[1]，其籽粒蛋白质及面筋含量都较普通小麦高，面筋较普通小麦硬，不能拉长，适合生产琥珀色、耐煮、光滑可口的通心粉，用硬粒小麦做的面条耐煮且有韧劲，因此又叫通心粉小麦。硬粒小麦还可以与普通小麦搭配磨粉来生产优质面包和其它面食品。硬粒小麦是六倍体普通小麦的初级基因库，含有丰富的抗性基因，对条锈、叶锈、散黑穗病和腥黑穗病等病具有较好的抗性，具有较高的育种价值[2-3]。

图2　硬粒小麦(Sauwne 20) 的A和B基因组的FISH核型

DNA重复序列可以用于染色体辨别、基因组组成及进化分析，外源遗传物质检测等多项研究。Mukai等[4]以高度重复序列pSc 119.2和pAs 1为探针识别了B组和D组所有染色体以及小麦的1 A、4 A和5 A 染色体，并创立了中国春小麦的B基因组和D基因组染色体核型模式图。Pedersen等[5]成功地使用pAsI和pHvG 38两个重复序列探针识别了小麦所有的21对染色体。 Cuadrado和Jouve[6]在黑麦染色体制片上用pTa 71、pTa 794、pSc 34、pSc 74和pSc 119.2重复序列探针进行了3次荧光原位杂交，从而识别了黑麦的全部染色体。目前，对硬粒小麦的FISH核型方面的研究鲜见报道。本研究拟对硬粒小麦染色体进行双色FISH分析，以期了解硬粒小麦染色体的FISH特点，建立其FISH核型，为硬粒小麦在小麦遗传育种上的利用和深入研究提供参考。

1　材料与方法

1.1　材　料

试验材料为从意大利引入的硬粒小麦品种Sauwne 20，该品种具有矮杆、千粒重大、白粒、全玻璃质等特点，并且对条、叶、秆锈病和白粉病等病表现高抗至免疫[7]，是小麦白粉病抗性的鉴别寄主。

1.2　染色体制片

将种子置于铺有湿润滤纸的培养皿中于常温下发芽，待根长至2 cm左右时，剪取根尖用N2O处理2 h，在90%冰醋酸中固定10 min,用蒸馏水冲洗3遍后切取根尖分生区，酶解滴片，在OLMPUS BX 60显微镜下镜检，选取分裂相好的片子保存于-20 ℃冰箱备用。

1.3　荧光原位杂交分析

FISH技术参见Han等[8]方法。选择FISH效果好的细胞用Cellsens Standard摄像系统照相。选取5个分裂相好且染色清晰的细胞用于FISH核型分析，以得到准确可靠的数据。

2　结果与分析

以Oligo-pTa 535-2(红色)和Oligo-pSc 119.2-1(绿色)重复序列为探针对硬粒小麦Sauwne 20根尖细胞染色体进行双色FISH分析(图1)，结果发现，Sauwne 20包括14对染色体，其染色体上的Oligo-pTa 535-2红色信号相对较弱且少，而Oligo-pSc 119.2-1绿色信号较强且丰富。

Sauwne 20的1 A染色体短臂端部和长臂中间分别具有Oligo-pTa 535-2信号(图2)。2 A染色体短臂端部及近着丝点处分别有明亮的Oligo-pTa 535-2信号。3 A染色体着丝点处有明亮的Oligo-pTa 535-2信号。4 A染色体长臂近端部有Oligo-pTa 535-2信号, 长臂端部有Oligo-pSc 119.2-1绿色信号。5 A染色体长臂中间存在2对弱的Oligo-pTa 535-2信号。6 A染色体短臂端部和近着丝点处分别有Oligo-pTa 535-2信号。7 A染色体长臂近端部和近着丝点处分别有微弱的Oligo-pTa 535-2信号。

注：Oligo-pTa 535-2探针为红色，Oligo-pSc 119.2-1探针为绿色，背景染色体由DAPI复染为蓝色；比例尺为10 μm。下同。图1　硬粒小麦(Sauwne 20)根尖细胞染色体的FISH核型

Sauwne 20在1 B染色体长臂端部和中间分别有Oligo-pSc 119.2-1信号。2 B染色体长臂、短臂端部及长臂中间分别有Oligo-pSc 119.2-1信号。3 B染色体短臂端部有Oligo-pSc 119.2-1和Oligo-pTa 535-2两种信号，长臂端部有Oligo-pTa 535-2信号。4 B染色体上具有较丰富的Oligo-pSc 119.2-1信号，在短臂端部、长臂中间与端部分别具有较强的Oligo-pSc 119.2-1信号。5 B染色体短臂端部和近端部有较强的Oligo-pSc 119.2-1信号。6 B染色体长臂和短臂端部及长臂中间分别具有Oligo-pSc 119.2-1信号；短臂端部及中间分别有Oligo-pTa 535-2信号。7 B染色体在短臂近端处和长臂端部、中间分别有明显的Oligo-pSc 119.2-1信号；长、短臂近端处分别有Oligo-pTa 535-2信号。

硬粒小麦Sauwne 20与Tang等[9]报道的中国春普通小麦的A组和B组染色体的FISH核型基本相似，但又有一定的差别。Sauwne 20的1 B和4 B染色体长臂近端处比中国春小麦多1对Oligo-pTa 535-2信号。Sauwne 20的3 B染色体短臂近端处比中国春小麦多1对Oligo-pTa 535-2信号。Sauwne 20的6 B染色体短臂近端处比中国春小麦多1对Oligo-pSc 119.2-1信号信号。Sauwne 20的7 B染色体长臂端部和近端处分别比中国春小麦多1对Oligo-pSc 119.2-1和Oligo-pTa 535-2信号。

3　讨　论

建立植物的FISH核型对研究植物分类和进化具有重要的意义[10-11]。董磊等[12]对拟斯卑尔脱山羊草材料进行了FISH分析，发现Oligo-pTa 535信号主要分布在小麦的A组和D组染色体上，Oligo-pSc 119.2信号主要分布在小麦的B组染色体上，不同来源的拟斯卑尔脱山羊草与小麦B染色体组的FISH核型存在明显差异；认为拟斯卑尔脱山羊草染色体上含有丰富的与pSc 119.2高度同源的重复序列，分布上具有遗传多样性。葛群等[13]利用普通小麦品种绵阳11作母本,抗病的威宁黑麦(ScealecerealeL.)作父本,在其杂交和回交后代中分别鉴定出一个1 R和5 R单体附加系；研究发现黑麦染色体1 R和5 R单体附加系可以诱导小麦染色体变异。罗巧玲等[14]分析了390份小麦-黑麦种质材料，指出3份六倍体小黑麦与2份八倍体小黑麦所含的黑麦染色体不完全相同；八倍体小黑麦中有1对来源于黑麦的小染色体,而六倍体小黑麦中没有类似小染色体。Tang等[15]以Oligo-pTa 535-1和Oligo-pSc 119.2-1为探针进行FISH分析，并结合GISH技术对小黑麦衍生种的染色体结构变异进行了分析。刘成等[16]利用Oligo-pTa 535-1、Oligo-pSc 119.2-1和(GAA)8探针对智利大麦进行FISH分析，有效辨别了智利大麦的每一条染色体。Linc等[17]则以重复序列pSc 119.2和Afa family为探针将二倍体长穗偃麦草的7对染色体全部区分，建立了二倍体长穗偃麦草的FISH核型，并对其附加系进行了鉴定。

本研究利用双色FISH技术可在染色体水平上准确辨别硬粒小麦Sauwne 20的每一染色体，并建立Sauwne 20的FISH核型。Sauwne 20染色体上的Oligo-pTa 535-2红色信号相对较弱且少，而Oligo-pSc 119.2-1绿色信号较强且丰富。Sauwne 20的FISH核型与Tang等[9]报道的中国春小麦A和B组染色体的FISH核型相似，但又有一定的差别；其差异可能是由于试验材料不同，不同小麦材料间DNA重复序列具有遗传多样性。Sauwne 20染色体结构变异可能是该材料形成过程中，染色体发生重复、倒位、易位、缺失等现象而导致染色体重复序列的变化，从而形成FISH信号的多样性[18]。

参考文献：

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3　讨　论

本研究以三白草作为材料分离AP1基因，通过RACE方法快速克隆出全长cDNA，获得全长cDNA，通过测序分析，确定该基因为1 076 bp的全长cDNA序列，共编码245个氨基酸。AP1基因既属于花分生组织特征基因，又是花器官形态特征基因，AP1基因具有促进植物开花的作用[6]。

AP1基因在花器官发育中起关键作用。在花发育的ABCDE模型中，AP1基因既属于A类基因，是萼片和花瓣正常发育所必需的，同时又能激活B类基因。AP1基因突变使一些花变成花序，导致萼片和花瓣发育异常。被子植物中有关花发育方面的研究主要集中在拟南芥、金鱼草和矮牵牛等模式植物中，AP1基因在这些高等真双子叶植物中的功能、表达以及氨基酸序列具有相似性。而在被子植物基部类群的三白草，其花序没有花萼和花瓣，但开花时顶端3片苞叶变白，通过RT-PCR基因表达分析，发现在白色花瓣状苞叶中AP1基因有表达。AP1在三白草植株开花时顶端苞片变白过程中有明显上调，而幼叶中几乎没有表达，这也许与A-class基因的异位表达有关系，所以在无被花的三白草中有可能出现花瓣异位表达的现象。

参考文献:

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