复合靶指数富集的配基系统进化技术研究进展

武振宁, 薛书江, 杨咏洁

(延边大学农学院, 吉林 延吉 133002)

核酸适配体是一类新的、具有高度特异性和亲和性的单链寡核苷酸(single-stranded DNA (ssDNA)或RNA),可发生适应性折叠形成特殊的三维结构(如发夹、假结、凸环、G-四分体等)[1]。这些特殊的三维结构使核酸适配体具有高度的分子识别能力,能够与靶物质特异性结合。这种特异性可与单克隆抗体相媲美,因此,被誉为“人工单抗”。除了高度的特异性和亲和力之外,核酸适配体还具有筛选周期短、易制备、易修饰、热稳定性和重复性好、无免疫原性等优点[2]。基于上述优良特性,核酸适配体在临床诊断[3-6]、药物研发[7,8]、疾病治疗[4,9,10]等领域极具应用前景。凡是涉及单抗的应用领域,几乎都可以用核酸适配体来取代。

核酸适配体的筛选一般是利用指数富集的配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技术,从人工合成的随机ssDNA或RNA文库中,经过反复的亲和性分离、PCR扩增,最终筛选获得高亲和力、高特异性的核酸适配体。SELEX技术是一种体外筛选过程,因此其靶标范围十分广泛(>150种),包括重组蛋白质、小分子、活细胞、微生物、组织等[11]。这些靶标可以是单一、纯化的靶标,也可以是多重、复合的靶标。而以多重、复合物为筛选靶标的SELEX技术称为复合靶SELEX技术[12]。但是,目前SELEX技术多数局限于单一、纯化的可溶性蛋白靶标。因为单一的靶标其结构稳定、筛选条件可控,因此更容易获得理想的核酸适配体。然而,针对单一靶标的筛选必须在明确靶标结构、特性并获得其纯品后,才可以进行。但是蛋白质的纯化过程繁琐,耗时费力,而且很多靶标(如血清中的低丰度蛋白质或细胞的膜蛋白)很难纯化获得单一纯品。复合靶SELEX技术则可以避免靶标的纯化过程,能够保持靶标的天然构象,并且可以在未明确靶标的组成及结构特性的前提下,通过高通量的盲筛获得一系列特异性核酸适配体。因此,探索和开发复合靶SELEX技术是十分必要的。本文主要介绍以未纯化的各种生物样本为复合靶的SELEX技术,以期为核酸适配体的筛选提供新思路。

1 完整的细胞

以完整的细胞为靶标筛选获得核酸适配体的技术称为Cell-SELEX技术[13]。一般细胞表面的膜蛋白具有非常重要的生理功能,如细胞的跨膜受体可以接受胞外信号分子而激活细胞信号通路。因此,很多跨膜蛋白(如G蛋白耦联受体、受体激酶、离子通道等)都是非常重要的已开发或尚未开发的生物诊断标志物或药物靶标[14-16]。然而,跨膜蛋白一般为两性分子且不易分离纯化,因此很难获得水溶性的纯品。Cell-SELEX则以完整的细胞为靶标,在筛选过程中,既避免了膜蛋白分离纯化的繁琐过程,又保留了细胞表面所有分子的天然构象和分布,而且在生理条件下进行筛选。因此,Cell-SELEX筛选的核酸适配体更有望应用于临床[17]。屈锋课题组[18]在近期发表了有关Cell-SELEX的综述,对该技术的相关研究进行了系统的总结。

Cell-SELEX技术筛选的靶标通常是某一已知的膜蛋白或特殊的细胞亚型。若筛选的靶标是已知的膜蛋白,一般将该蛋白质表达于细胞膜的表面,然后以过表达该膜蛋白的完整细胞为靶标进行筛选,而以不表达该蛋白质的细胞为消减靶标以消除非特异性的核酸适配体。利用该方法成功筛选获得了转化生长因子βⅢ型受体(TGFβRⅢ)[19]、α整合素V[20]等的特异性核酸适配体。为了提高筛选的成功率,在此基础上又衍生了hybrid-or crossover-Cell-SELEX即分别以纯化的重组蛋白质和过表达该重组蛋白质的细胞为靶标,交替进行筛选以提高核酸适配体的特异性[21]。利用该方法获得了转铁蛋白受体(TfR)[22]、细胞粘合素-C(TNC)[23]的特异性核酸适配体。

在未明确某一具体靶标的情况下,也可以以完整的某个特殊的细胞亚型为筛选靶标,而以与其结构类似的细胞亚型为消减靶标,盲筛获得能够区分两种细胞亚型的适配体群。目前,利用消减法筛选获得的核酸适配体能够特异性识别结直肠癌细胞[24]、鼻咽癌细胞[16],能区分T急性淋巴细胞瘤和B淋巴细胞瘤[25]、小细胞肺癌和大细胞肺癌[26]。在Cell-SELEX筛选过程中,不管筛选的是哪一类型的靶标,都要引入消减法以避免非特异性核酸适配体的平行富集。

此外,利用Cell-SELEX技术不仅能够筛选到跨膜蛋白的核酸适配体,而且还能够进一步发现新的诊断标志物。如CD109[16]、B-淋巴细胞抗原CD20[27]等就是利用筛选到的核酸适配体再结合质谱确定的诊断标志物。最近,Mayer等[28]利用荧光激活的细胞分选SELEX技术即FACS-SELEX技术,将核酸适配体进行荧光标记,利用流式细胞仪将与靶细胞结合的核酸适配体进行了分离,实现了核酸适配体的高通量筛选。

2 血清和细胞溶解物

凝胶电泳技术与SELEX技术相结合是一种有效的核酸适配体筛选工具,非常适合于筛选未纯化可溶性的生物样本(如血清、细胞溶解物)。常用的凝胶电泳包括:十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、毛细管电泳(CE)及电泳迁移率实验(EMSA)。SDS-PAGE是蛋白质在变性条件下,根据蛋白质分子量大小对其进行分离;毛细管电泳是以毛细管为分离通道,在微升甚至纳升水平对蛋白质进行分离,分辨率高,所用的蛋白质样品量极低,是一种高效的分离、分析方法;EMSA最初用于DNA/RNA结合蛋白质和其相关的DNA/RNA结合序列互作研究,现在也可以用于研究核酸适配体及其结合蛋白质互作。在非变性条件下,核酸-蛋白质复合物比游离的核酸移动速率慢,从而可以将结合的和游离的核酸分离。

2.1 血清

血清由于取材容易、创伤小,是目前最为理想的临床诊断标本。血清中蕴藏着十分丰富的诊疗信息,是用于发现疾病诊断标志物或治疗靶标的最佳样本。但由于血清的组成过于复杂,一些有价值的、潜在的诊断标志物常因丰度低而被高丰度蛋白质所掩盖,因此以血清为靶标的核酸适配体筛选鲜有人探索。直至2015年,邵宁生等[29]首次利用消减-EMSA-SELEX技术,以肝癌患者的甲胎蛋白(AFP)阴性血清为筛选靶标,以正常健康人的血清为消减靶标,根据游离的ssDNA和结合的ssDNA在电场中的迁移率不同,利用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将二者进行分离,经过5轮重复筛选,将最后一轮的ssDNA与血清蛋白质的复合物进行质谱鉴定,最终确定vasorin为肝癌患者候选的血清诊断标志物。该研究表明,利用消减-EMSA-SELEX技术能够筛选到用于鉴别正常人与癌症患者血清的核酸适配体,并可以进一步用于确定疾病的诊断标志物。2017年,栗坤等[30]以琼脂糖微珠为固相载体,将血清固定于琼珠的表面,以肺癌患者血清为正筛靶标,以健康人的血清为消减靶标,利用靶替换的消减SELEX技术即每轮都进行阴性与阳性筛选,最终经过10轮筛选获得6条核酸适配体序列。该方法虽然也实现了血清核酸适配体的筛选,但需要将血清蛋白质固定于微珠上,而微珠的表面积有限,很可能会遗漏一些潜在的、有价值的诊断标志物。

本课题组目前也在利用消减-EMSA-SELEX技术筛选能够鉴别布鲁氏菌感染与免疫的血清核酸适配体。筛选过程中发现,ssDNA与血清直接孵育后会导致部分ssDNA降解,回收率降低。为了克服这一局限性,可以考虑将ssDNA文库进行修饰或加入DNA酶抑制剂,以避免ssDNA的降解。另外,由于筛选的核酸适配体多为短链寡核苷酸(<80 nt),而市面上很少有专门用于回收短链寡核苷酸的试剂盒,醇沉法的ssDNA回收率又很低。因此,如何提高ssDNA的回收率也是亟待解决的问题。

2.2 细胞溶解物

对于已知靶蛋白质的核酸适配体筛选,常规方法是先利用某种培养的细胞对靶蛋白质进行过表达,然后从该细胞溶解物中纯化靶蛋白质,之后再以纯化的重组蛋白质为靶标筛选核酸适配体。然而,从细胞溶解物中纯化蛋白质操作繁琐、耗时,且具有一定挑战性。为了避开这一难题,Kanoatov等[31]以DNA错配修复蛋白质MutS为筛选靶标,将其重组表达后并未纯化,而是直接以表达MutS的细胞溶解物为靶标进行正筛,再以不表达该蛋白质的细胞溶解物为消减靶标进行反筛,仅需5轮筛选即获得了MutS的核酸适配体。该研究表明,以未纯化的细胞溶解物为靶标,不需要对重组蛋白质进行纯化,也可以实现核酸适配体的筛选。但是,该方法必须在靶蛋白质已知的情况下,实施核酸适配体的筛选。另外,Javaherian等[32]利用上述方法筛选获得的核酸适配体作为亲和试剂,开发了一种基于核酸适配体的细胞蛋白质分离方法(AptaPIC),用于分离、纯化细胞溶解物中的蛋白质。

针对复杂生物样本(如细胞溶解物、血清),在未明确靶蛋白质的前提下,利用二维凝胶电泳(2DE)-SELEX技术结合Western-blot (WB)技术,可以实现核酸适配体的高通量筛选。2DE可以将复合靶蛋白质完全分离,然后利用WB技术将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上,之后实施核酸适配体筛选。Savory等[33]利用该方法以鼠的肝组织提取物为靶标,以未知蛋白质(pI为4.5,相对分子质量为35 kDa)为靶点,经4轮筛选即获得靶蛋白质的特异性核酸适配体。同时,利用适配体的印迹试验分析了适配体与靶蛋白质(pI为4.5,相对分子质量为35 kDa)结合的特异性和亲和性。利用2DE-SELEX技术筛选的核酸适配体,可进一步用于蛋白质组学分析及生物标志物发现。然而,蛋白质在经2DE分离及电转至膜上的过程中很可能发生变性,蛋白质的空间结构可能被破坏。另外,2DE及WB方法操作过程繁琐、耗时,而且试验的准确性及重复性差。若整个操作过程可以实现自动化,则能够弥补其不足之处。最近,全自动电泳仪系统可以实现电泳和电转印的自动化,整个过程只需1 h[34]。这些自动化系统可以改善2DE-SELEX技术的准确性及重复性问题。另外,利用2DE-SELEX技术并结合质谱,可以用于同时发现多个生物标志物及对应核酸适配体的研究,是一种高效的筛选生物标志物及对应核酸适配体的新战略。

3 组织

以组织为靶标的SELEX技术包括体内的In vivo-SELEX技术和体外的组织切片-SELEX技术[35]。

3.1 In vivo-SELEX

In vivo-SELEX是以活的动物体内的肿瘤组织为靶标筛选特异性核酸适配体[32]。整个筛选过程与传统的SELEX技术很相似,不同之处就在于利用活体动物而不是纯化的蛋白质进行筛选。整个过程的关键在于直接将ssDNA文库注射入动物体内,ssDNA通过血液循环流入靶组织并与之结合,手术切除靶组织后收集结合的ssDNA。Mi等[36]建立了结直肠癌肝转移小鼠模型进行In vivo-SELEX筛选。由于是体内筛选,研究者将文库进行了修饰(2′-氟代嘧啶),将修饰的RNA文库通过尾静脉注射入小鼠体内,在注射20～30 min之后,收集含有转移瘤的肝组织、提取RNA适配体、PCR扩增。重复以上操作步骤,经过14轮筛选最终获得高亲和力的P68核酸适配体。P68为治疗结直肠癌药物的候选靶标,是RNA解螺旋酶,在结直肠癌中上调表达。该研究表明,利用In vivo-SELEX技术,未经纯化过程也能够获得组织特异性核酸适配体。同样的,DHX9的核酸适配体也是利用该方法成功筛选获得[37]。此外,Cheng等[38]利用In vivo-SELEX技术经过22轮筛选,获得能够穿透野生型小鼠血脑屏障的RNA适配体。同时,利用原位杂交技术确定了该核酸适配体的组织分布情况,其分布于大脑皮层、海马、小脑和纹状体。以上研究表明,In vivo-SELEX技术可以免去体外SELEX技术很多繁琐步骤(如细胞的分离、收集等过程),能够生成组织特异性的核酸适配体。然而,In vivo-SELEX技术由于需要将大量的寡核苷酸文库注入动物体内,目前只能用于小动物模型。对于大动物模型则很难实施,因为需要更大量的寡核苷酸文库和更长时间的血液循环。

3.2 组织切片-SELEX技术

组织切片一般用于常规的病理诊断,病理组织被切割至几微米厚,并固定于载玻片上。组织切片-SELEX技术是以固定在载玻片上的组织薄片为靶标,寡核苷酸文库直接与组织孵育、洗脱,收集结合寡核苷酸、PCR扩增,如此反复,最终筛选获得特异性核酸适配体[39]。目前,利用该技术已成功筛选获得能够识别各种临床组织标本的核酸适配体,包括卵巢癌肿瘤组织[15]、乳腺癌组织[40]等。该技术主要有以下几个优点:一、筛选的核酸适配体更具代表性、更具有临床应用价值,因为它是以临床组织标本为靶标而不是以培养的细胞系为靶标;二、以组织切片为靶标,可以筛选获得针对组织中各组分的核酸适配体,包括胞内蛋白质、细胞膜组分及胞外基质,尤其是胞内蛋白质(如溶酶体、凋亡因子、转录因子等);三、获得的核酸适配体可以作为一个新的分子检测探针用于病理诊断。

4 小结

SELEX技术一般是以单一、纯化的蛋白质靶标为“诱饵”,然而,对于生物样本中的一些低丰度蛋白质、膜蛋白及未知的蛋白质,无法获得单一纯品,因此按常规方法无法筛选获得核酸适配体。复合靶SELEX技术则无需纯化蛋白质,在保持生物样本天然构象和活性的前提下,甚至可以在未知靶标结构和组成的前提下,实施核酸适配体的筛选。然而,以未纯化的生物样本为靶标筛选核酸适配体时,由于该类复合靶标成分复杂、结构多样,导致筛选的核酸适配体特异性不强,很难应用于临床。因此,目前复合靶SELEX技术最具挑战性的就是核酸适配体能否与其靶标特异性结合。